牙源性干細(xì)胞成骨能力的研究進(jìn)展

程倩鈺，鄭荔文，林居紅★

（1.重慶醫(yī)科大學(xué)附屬口腔醫(yī)院 兒童口腔科，重慶；2.口腔疾病與生物醫(yī)學(xué)重慶市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶；3.重慶市高校市級口腔生物醫(yī)學(xué)工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶）

0 引言

面部骨質(zhì)缺損常由腫瘤，創(chuàng)傷和炎癥引起，而衰老，骨質(zhì)疏松，糖尿病等一些系統(tǒng)因素會加重骨丟失，從而影響骨修復(fù)[1,2]。當(dāng)前，在臨床上，重新建造破壞骨頭的主要方法是自體或者異體骨移植。其中，最不可被忽略的問題有兩個，分別是：手術(shù)創(chuàng)傷和免疫排斥[3]。近年來，基于干細(xì)胞的組織工程用于恢復(fù)骨質(zhì)缺損顯示出了巨大潛力。而在這些干細(xì)胞里，由于牙源性干細(xì)胞具有自身優(yōu)異的自我更新能力、高度增值性，并且比較容易獲得，比如可以在正畸牙和智齒中高效獲得，因此受到了學(xué)者們的青睞。同時，由于它是一種成體干細(xì)胞，所以比胚胎干細(xì)胞以及誘導(dǎo)多能干細(xì)胞更能被大眾接受，并且在維持、更新以及修復(fù)牙和牙周圍組織方面起到不可或缺的作用[4]。

學(xué)者已經(jīng)廣泛而細(xì)致地研究了牙源性干細(xì)胞的培養(yǎng)、鑒定、遷移、增殖以及分化，并且做了大量的體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)。目前，一些干細(xì)胞，如牙周膜干細(xì)胞（PDLSCs）、牙囊干細(xì)胞（DFSCs）和牙齦干細(xì)胞（GMSCs）已成功從一些牙體牙周組織（牙髓、牙周膜、根尖乳頭及其他的牙體牙周組織）中分離和培養(yǎng)。我們知道，一般間充質(zhì)干細(xì)胞可以表達(dá)相同的表面標(biāo)記物，并能成骨、軟骨，成脂及成神經(jīng)分化，而牙源性干細(xì)胞來自于神經(jīng)嵴的間充質(zhì)干細(xì)胞，因此它也具有這種特性[5]。再具體一點(diǎn)，它可以表達(dá)神經(jīng)干細(xì)胞標(biāo)記物nestin 和notch，同樣也表達(dá)如血管生成素1（Ang-1），環(huán)加氧酶-2（Cox-2），肝配蛋白B2 和成牙本質(zhì)標(biāo)記物如牙本質(zhì)涎磷蛋白（DSPP）和牙本質(zhì)基質(zhì)蛋白1(DMP-1) 等一些與內(nèi)皮細(xì)胞有關(guān)的表面分子。不僅如此，成骨標(biāo)記物也可以被它表達(dá)，例如堿性磷酸酶（ALP），I 型膠原蛋白（Col I），骨鈣蛋白（OCN）和骨橋蛋白（OPN）[6,7]。有文獻(xiàn)表明，在特定條件下，牙源性干細(xì)胞能夠分化為骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞，因此牙源性干細(xì)胞是骨再生潛在的干細(xì)胞來源之一[8]。牙源性干細(xì)胞的成骨能力是被大家接受的，但是對于不同的牙源性干細(xì)胞，它們的成骨潛力是不一樣的，因此接下來我們將詳細(xì)概述不同干細(xì)胞的成骨潛力、影響因素和在骨再生中的應(yīng)用。

1 DPSCs

牙髓是一種位于由牙本質(zhì)圍成的髓室和根管內(nèi)的一種疏松結(jié)締組織。它不僅可以形成牙本質(zhì)，并具有營養(yǎng)、感覺、防御能力以及創(chuàng)傷修復(fù)再生能力。2000 年，有人從人的第三磨牙的牙髓中提取出呈纖維細(xì)胞樣形態(tài)的DPSCs。它不僅具有與BMSCs（骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞）相似的功能，而且具有成骨、成脂、神經(jīng)源性、軟骨源性和肌源性分化潛能，還可以修復(fù)和再生牙髓牙本質(zhì)復(fù)合體[9]。已有臨床試驗(yàn)證明，因外傷牙髓壞死的年輕恒牙用乳牙的DPSCs修復(fù)，牙髓組織可以再生，并且還促進(jìn)了牙根發(fā)育[10]。STRO-1、CD29、CD44、CD46、CD73、CD105、CD106 等多種間充質(zhì)干細(xì)胞表面標(biāo)志物都可以由DPSCs 表達(dá)，并且它的增殖和克隆能力很強(qiáng)，能在不同誘導(dǎo)環(huán)境下多向分化。

1.1 DPSCs 的成骨潛能

CD44+/RUNX2+成骨細(xì)胞前體可以由DPSCs 分化，在成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基中進(jìn)一步分化為成骨細(xì)胞。將DPSCs 在成骨誘導(dǎo)液中培養(yǎng)5-6 周后，沉積了高密度散在的鈣鹽，并檢測到了ALP 的表達(dá)，這些結(jié)果證實(shí)了DPSCs 的成骨分化能力[9]。值得注意的是，有人將人的DPSCs 移植到大鼠缺損的顱骨中，這些DPSCs 可以在不受機(jī)體排斥的情況下分化為成骨細(xì)胞[11]。

1.2 DPSCs 成骨能力的影響因素

與地塞米松比較，殼聚糖更能提升DPSCs 的增值能力，并且促進(jìn)成骨向的早期分化[12]。同時，一些研究證實(shí)DPSCs 的成骨分化可以被許多的生長因子促進(jìn)。例如，骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2 (BMP-2) 能促進(jìn)DPSCs 成骨分化。當(dāng)BMP-2 轉(zhuǎn)染DPSCs 后再移植到裸鼠皮下之后，形成了骨髓樣細(xì)胞、骨樣細(xì)胞、礦化組織等，并且形成新骨的能力更強(qiáng)，而且在新骨表面，骨細(xì)胞樣細(xì)胞被有序排列成[13]。DPSCs 由酪氨酸激酶受體的配體B2（EphrinB2）過表達(dá)后，將會有更多的鈣鹽在體外沉積，RUNX2，BMP2，OCN 基因和蛋白表達(dá)水平也變得更高。在體外實(shí)驗(yàn)犬骨缺損模型中，EphrinB2修飾的犬DPSCs 加速了骨再生，表明EphrinB2 信號可能是促進(jìn)DPSCs 成骨的潛在靶點(diǎn)[14]。另外，某些生物材料也能提升干細(xì)胞的成骨能力，比如磷酸鈣生物陶瓷與硅酸鈣的結(jié)合可有效誘導(dǎo)DPSC 的ALP 和OCN 表達(dá)[15]。

1.3 DPSCs 在骨再生中的應(yīng)用

PLC-BCP（聚-ε- 己內(nèi)酯- 雙相磷酸鈣）生物支架材料與DPSCs 相結(jié)合，被一起植入到兔顱骨缺損處，不僅形成了結(jié)構(gòu)更良好的血管化骨組織，并且再生能力也更強(qiáng)[16]。與單一的細(xì)胞植入相比，在支架材料（如在藻酸鹽凝膠、致密膠原凝膠）上固定DPSCs 之后再植入裸鼠皮下形成的新骨成骨能力更強(qiáng)[17,18]。DPSCs 也可用于治療牙槽骨缺損。具體步驟是：自體的DPSCs 在患者拔除智齒時被提取，然后混合到膠原支架后一起被植入拔牙窩，三個月后拍片發(fā)現(xiàn)，在牙槽窩里新的骨頭形成，并且相鄰的磨牙中的牙槽骨高度及牙周附著都恢復(fù)地很好。這個結(jié)果說明，DPSCs 治療更好的實(shí)現(xiàn)骨和牙周組織的修復(fù)[19]。因此，DPSCs 在頜面部骨再生中將占據(jù)不可或缺的地位。

2 SHED

SHED 是一種未分化的間充質(zhì)干細(xì)胞，可以從人脫落乳牙的牙髓組織中分離得到。與DPSCs 一樣，SHED 都是來源于牙髓，并且具有多向分化能力以及能誘導(dǎo)產(chǎn)生牙髓樣組織，不同之處在于細(xì)胞形態(tài)、增殖能力及成骨能力等方面[20]。STRO-1，CD146(MUC18)，ALP、人細(xì)胞外基質(zhì)磷酸糖蛋白（MEPE）、內(nèi)皮抑素、Nestin、βIII-微管蛋白等多種間充質(zhì)干細(xì)胞表面標(biāo)志物由SHED 表達(dá)[21]。

2.1 SHED 的成骨潛能

在含有L- 抗壞血酸-2- 磷酸、地塞米松和無機(jī)磷酸鹽的培養(yǎng)液中培養(yǎng)SHED 四周后，Miura 等[21]檢測到阿利扎林紅陽性結(jié)節(jié)的形成，通過對Westernblot（蛋白免疫印跡）的分析，ALP，MEPE 和BSP（骨唾液酸蛋白）等成骨標(biāo)記物上調(diào)，并且證明了SHED 的成骨能力。受體小鼠細(xì)胞能在SHED 的誘導(dǎo)下分化成骨形成細(xì)胞[21]，而有研究表明，通過檢測將SHED 移植到免疫功能缺陷的小鼠體內(nèi)后新形成的骨組織的骨再生能力與骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BMMSC）相似，表明SHED 本身具有成骨分化的能力[22]。

2.2 SHED 成骨能力的影響因素

與地塞米松相比，視黃酸提升SHED 成骨能力的效果更好，而且與胰島素結(jié)合的視黃酸具有更好的促成骨作用[23]。通過半定量PCR 分析用BMP-4 處理脫落乳牙干細(xì)胞后，CBFA1（核心結(jié)合因子a1），Osterix（鋅指結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)錄因子）和Osteocalcin（骨鈣素）等成骨相關(guān)基因上調(diào)表達(dá)[21]。與DPSCs 相反，SHED 的ALP 活性，礦化結(jié)節(jié)、下游成骨相關(guān)基因表達(dá)都降低，并且它的成骨分化被堿性成纖維細(xì)胞生長因子所抑制[24]。

2.3 SHED 在骨再生中的應(yīng)用

SHED 的成骨潛能在小型豬牙槽骨缺損實(shí)驗(yàn)中得到證實(shí)[25]。具體操作為：在小型豬的頦部唇側(cè)形成骨缺損，將混入磷酸三鈣(β-TCP) 支架的自體脫落乳牙干細(xì)胞植入缺損處，4 周后檢測退化的支架材料時發(fā)現(xiàn)形成骨組織和血管，六個月后發(fā)現(xiàn)，在缺損處有大量新生骨形成。還有學(xué)者將小型豬的牙槽骨缺損處植入混合富血小板血漿的異體干細(xì)胞（狗的SHED）[26]，但是目前為止還沒有研究報道用SHED 修復(fù)人的頜面部骨缺損，因此，需要大量的臨床試驗(yàn)來證實(shí)。

3 PDLSCs

牙周膜是特有的纖維結(jié)締組織，位于牙骨質(zhì)和牙槽骨之間，與牙齒的維護(hù)和支持有關(guān)。牙根與牙槽骨之間的動態(tài)連接，由從牙周膜中分離出來的PDLSCs 的增殖分化維持著，并且平衡著咀嚼壓力[27]。PDLSCs 表達(dá)的表面分子有α-SMA（α-平滑肌肌動蛋白）、ALP、OPN、OCN、FGF-2，CD105、CD146 和CD166 等。

3.1 PDLSCs 的成骨潛能

牙周膜干細(xì)胞在體外可以誘導(dǎo)形成成骨樣細(xì)胞，并且增強(qiáng)了ALP 染色，生成了鈣結(jié)節(jié)，也提高了成骨相關(guān)蛋白的表達(dá)水平[28]。有研究表明，使用間接共培養(yǎng)方法之后，成骨細(xì)胞前體成骨向分化和破骨細(xì)胞前體破骨向分化可以用PDLSCs 促進(jìn)[29]。大鼠的牙周缺損可以用在體內(nèi)與羥基磷灰石混合后的牙周膜干細(xì)胞修復(fù)，這樣不僅可以修復(fù)缺損的骨組織，也可以形成新的牙周附著。

3.2 PDLSCs 成骨能力的影響因素

作為最有效的成骨誘導(dǎo)劑之一，BMP-9 通過牙周膜干細(xì)胞中的MAPK 介導(dǎo)能夠誘導(dǎo)成骨分化[30]。PDL 細(xì)胞可以在與BMP-2和BMP-7 結(jié)合時的刺激下分化為成骨細(xì)胞，同樣也提升了礦化組織標(biāo)志物的表達(dá)，但是細(xì)胞毒性會在濃度大于10ng/mL 時產(chǎn)生[31]。Liu 等[32]證實(shí)，在牙周膜干細(xì)胞成骨分化中Wnt 信號可以起到作用，并且ALP 活性在激活Wnt 信號通路后明顯增高。在混合培養(yǎng)PDLSCs 與 VEGF(血管內(nèi)皮生長因子)之后，明顯增強(qiáng)了ALP 活性，促進(jìn)了鈣結(jié)節(jié)的生成，同時也增強(qiáng)了下游成骨相關(guān)基因的表達(dá)[33]。

3.3 PDLSCs 在骨再生中的應(yīng)用

牙周膜干細(xì)胞的成骨潛能在小型豬牙槽骨缺損實(shí)驗(yàn)中得到證實(shí)。在缺損處植入與羥基磷灰石/磷酸三鈣(HA/TCP）支架結(jié)合后的自體PDLSCs，形成大量的血管化骨[34]。在3 位有嚴(yán)重的牙周病患者的骨缺損處，其中2 人能形成臨床組織再生，而另一人未形成，但可以改善牙齒松動度和探診深度[35]。與其他牙源性干細(xì)胞相比較，PDLSCs 成骨能力強(qiáng)，可以再生牙骨質(zhì)-牙周膜復(fù)合體，如果與細(xì)胞因子和支架材料結(jié)合之后，將是一種重要有效的牙槽骨修復(fù)的方法。

4 SCAPs

松散地附著在沒有成熟的恒牙頂端的軟組織被稱為根尖牙乳頭，其與牙髓之間有一個富含間充質(zhì)干細(xì)胞的區(qū)域。可以從酶消化和外植體培養(yǎng)從中提取SCAPs，也可以從拔除的智齒中獲得，并且與牙髓、牙周膜干細(xì)胞相比，它具有更高的增殖能力，因此受到了青睞[36]。由于根尖牙乳頭干細(xì)胞的高自我更新能力和低免疫原性，如成骨源性、牙源性、神經(jīng)源性、脂肪源性、軟骨源性和肝源性等各種細(xì)胞譜系可以被分化得到（FGHI）。標(biāo)記物STRO-1、OCT3/4、Sox-2、Nanog、Notch3、波形蛋白、CD13、CD24、CD29 、CD44 等可以SCAPs 陽性表達(dá)。其中在DPSCs 中不可以檢測到CD24，因此可以區(qū)分開SCAPs 和DPSCs[37]。

4.1 SCAPs 的成骨潛能

骨相關(guān)基因在體外的SCAPs 成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)后被檢測到，ALP、RUNX2、OCN 表達(dá)上調(diào)，紅染的鈣結(jié)節(jié)可以用茜素紅染色檢測到[38]。免疫功能不全的大鼠體內(nèi)被植入SCAPs，周圍包繞著骨樣細(xì)胞和牙骨質(zhì)樣細(xì)胞的牙骨質(zhì)-編織骨樣組織被檢測到，因此SCAPs 成牙骨質(zhì)、成骨分化的能力得到證實(shí)[39]。

4.2 SCAPs 成骨能力的影響因素

多種因子可以影響SCAPs 的成骨能力，比如骨形態(tài)發(fā)生蛋白2（BMP2），BMP9，SH3 和多個錨蛋白重復(fù)結(jié)構(gòu)域2，GATA 結(jié)合蛋白4 ，核因子I-C、磷酸二氫鉀，經(jīng)典的NF-kappaB 信號通路，wnt/β-catenin 信號通路等。與牙周膜干細(xì)胞一致，胰島素樣生長因子也能使SCAPs 成骨作用增強(qiáng)[40]。

4.3 SCAPs 在骨再生中的應(yīng)用

在裸鼠腎包膜內(nèi)植入與可吸收明膠海綿支架混合的SCAPs后，形成大量鈣化組織[41]。SCAPS 移植治療骨缺損的可行性也得到了證實(shí)，在被植入與支架材料混合的干細(xì)胞之后的免疫功能不全的小鼠皮下，在一段時間后生成了異位骨組織[42]。但是目前為止，還沒有研究根尖牙乳頭干細(xì)胞的臨床實(shí)驗(yàn)，這需要大量實(shí)驗(yàn)研究SCAPs 的表征，分化調(diào)控，及在再生領(lǐng)域的應(yīng)用。

5 DFSCs

圍繞在發(fā)育中的牙齒周圍的由外胚間葉衍生的疏松結(jié)締組織被稱為牙囊，并且在牙齒的不同階段起著不同作用，并且牙周膜細(xì)胞、牙骨質(zhì)細(xì)胞和成骨細(xì)胞的祖細(xì)胞在牙囊中分化。在不同的微環(huán)境中培養(yǎng)DFSCs，牙本質(zhì)再生、礦化基質(zhì)的形成、牙髓牙本質(zhì)復(fù)合體及牙周膜的形成都得到促進(jìn)[43]。從拔除的阻生智齒，或年輕的正畸牙中提取的DFSCs 可以顯示出成纖維細(xì)胞樣的形態(tài)，STRO-1、CD13、CD31、CD44、CD73、CD105、CD106、CD146，SSEA-4、OCT-4 表面標(biāo)志物可以表達(dá)[44]。

5.1 DFSCs 的成骨潛能

Sonoyama 等[45]證明DFSCs 可以分化為成骨細(xì)胞，具有成骨潛能，因?yàn)樗麄冊隗w外將DFSCs 成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)，生成了鈣結(jié)節(jié)并且形成了類骨質(zhì)樣結(jié)構(gòu)。小鼠和大鼠的DFSCs 在牙冠形成階段可以分化為成骨細(xì)胞系得到證實(shí)[46]。有研究表明，DFSCs 與PDLSCs、BMSCs 成骨能力相近，他們將豬的這些物質(zhì)用于修復(fù)臨界骨缺損，4 周之后形成了并無明顯差異的新骨[47]。

5.2 DFSCs 成骨能力的影響因素

I 型膠原、IV 型膠原、層粘連蛋白和纖維連接蛋白四種細(xì)胞外基質(zhì)被研究對DFSCs 增值和分化的影響，Hondal 等[47]表明促進(jìn)細(xì)胞增值并促進(jìn)成骨向分化的只有I 型膠原。Xu 等[48]在地塞米松和人重組BMP-2 中培養(yǎng)細(xì)胞，之后混合了三維支架材料β-TCP，然后植入到免疫缺陷小鼠背部，形成了新骨，證實(shí)多種細(xì)胞因子能調(diào)節(jié)DFSCs 的成骨能力。BMP-9 能顯著提高DFSCs 的成骨潛能也得到證實(shí)[49]。

5.3 DFSCs 在骨再生中的應(yīng)用

研究者將干細(xì)胞與與脫鈣骨基質(zhì)支架和纖維蛋白凝膠混合后植入迷你豬下頜骨的圓柱形骨缺損處，8 周以后形成了新骨，并且是皮質(zhì)骨，osteocalcin 和VEGF 表達(dá)也明顯上升[50]。但是，DFSCs臨床研究還未見有人報道，因?yàn)閺?fù)雜的牙囊結(jié)構(gòu)和需要優(yōu)化的DFPC 提取，為了修復(fù)組織缺損，其分化基質(zhì)和調(diào)控需要大量實(shí)驗(yàn)研究。

6 GMSCs

牙齦是一種結(jié)構(gòu)組織，覆蓋在牙槽突表面和牙齒頸部周圍的口腔粘膜，包括上皮及下皮，并且它的修復(fù)能力很強(qiáng)。GMSCs 是一種間充質(zhì)干細(xì)胞，易分離得到，具有抗炎和抗菌作用，并且增殖很快。CD29，CD44，CD90，CD105，CD146，和STRO-1 都是牙齦干細(xì)胞表達(dá)間充質(zhì)干細(xì)胞的表面標(biāo)志物。

6.1 GMSCs 的成骨潛能

通過培養(yǎng)來自于39 個人健康和發(fā)炎的GMSCs，Ge 等[51]得到這兩種細(xì)胞群都可以分化成骨細(xì)胞，但是有炎癥的GMSCs 的分化能力不如健康的。并且移植的GMSCs 可以在下頜骨缺損和顱骨缺損處形成新骨也得到了證實(shí)，表明骨組織缺損可以被GMSCs 修復(fù)[52]。

6.2 GMSCs 成骨能力的影響因素及在骨再生中的應(yīng)用

目前對影響GMSCs 成骨能力的因素的研究少之甚少。大鼠缺損區(qū)新骨（小且局限）的形成可以在GMSC 與膠原蛋白凝膠的結(jié)合下得到促進(jìn)，GMSCs 直接參與骨修復(fù)，還能募集宿主骨祖細(xì)胞以促進(jìn)骨再生[53]。狗的牙周組織缺損被GMSCs 之后，牙槽骨，牙骨質(zhì)和功能性牙周膜明顯增加[54]。不管在有無炎癥環(huán)境下，GMSCs 的分化潛能都低于PDLSCs，但是在炎癥性牙周疾病的治療中，GMSCs 會有獨(dú)一無二的作用，所以還需要大量的研究。

牙源性干細(xì)胞自提出以來就備受關(guān)注，因?yàn)樗容^容易獲得，分化潛能大，更新能力強(qiáng)，傳代后保持干性，和倫理的優(yōu)越性。多種牙源性干細(xì)胞的成骨特性被大量研究證實(shí)，并且也提升了成骨調(diào)控和應(yīng)用。但是在用于人體修復(fù)骨組織缺損這一方面，仍然面臨著許多挑戰(zhàn)。首先，分離純化沒有特異性表面標(biāo)記物的牙源性干細(xì)胞這一問題很棘手。其次，現(xiàn)在還尚未清楚許多牙源性干細(xì)胞分化的調(diào)控機(jī)制，在用于臨床之前，還要進(jìn)行大量研究。但是我們相信，在科學(xué)技術(shù)快速發(fā)展的這一背景下，干細(xì)胞顱面組織工程將會發(fā)揮更大的臨床應(yīng)用潛能。