病證結合動物模型研究概述＊

王靖怡，高嘉良，王 階

（中國中醫科學院廣安門醫院 北京 100053）

目前,病證結合是中醫臨床診療的重要模式，強調臨床診療過程中既重視西醫疾病的診斷，又注重中醫證候的認識[1]。中醫藥要實現質的飛越，與世界接軌，需要繼承發展、守正創新，在中醫藥理論內涵、作用機制、療效評價及新藥研發等多個環節獲取有力佐證。在中國悠久的歷史長河中，中醫藥臨床療效顯著有目共睹，但如何從基礎研究對其有效性進行驗證仍是亟需攻克的關鍵難題。有鑒于此，研究者將目光轉向病證結合動物模型這個重要載體，其也日益成為中醫實驗動物模型的研究熱點而廣受關注，故本文對目前病證結合動物模型研究概況進行了簡要梳理。

1 病證結合動物模型是實現中醫藥現代化發展的關鍵

西醫學之“病”以西醫理論體系為基礎，聚焦人體細胞、組織、器官等結構與功能方面的病理變化，從全程和特征上認識疾病本質[2]，并以此為治療依據[3]。“證”是中醫學特有的概念，作為疾病的“橫斷面”，反映疾病發生發展過程中某一階段的病理本質，涵蓋病因、病位、病性、病機、病勢及虛實邪正等方面內容，強調與疾病相關的各種因素共同作用于機體所體現的整體反應特性[3]。“病”“證”結合臨床診療及科研模式是中西醫學兩種體系的結合，旨在融合疾病與證候體系，研究疾病的發生、發展規律，便于指導臨床防治疾病[4]，其優越性早在朱肱的《南陽活人書》中就有所提及：“因名識病，因病識證，如暗得明，胸中曉然，無復疑慮而處病不差矣。”

證候是中醫學的理論核心，辨證論治是臨床治療的基礎。證候不僅是對臨床現象的歸納總結，更是聯系中醫理論與臨床實踐的關鍵樞紐。“有諸內必形諸于外”，證候的外在表現為四診宏觀信息所體現的具有規律性的病理生理過程，而其內在規律性的物質基礎尚待進一步挖掘[5]。證候實質的揭示不僅能夠促進辨證論治的客觀化與科學化，更是實現中醫藥現代化，與世界接軌的必經之路，而病證結合正是證候本質研究的關鍵手段之一。在探尋證候實質和深化機制認識等方面，動物模型都是重要的工具和手段[6]。病證結合動物模型的建立旨在探索病理生理變化與證候特征之間的關聯，從基礎研究的角度為中醫藥療效發聲，提供客觀有力的支持與依據，在中藥篩選、機制研究、新藥開發乃至中西醫理論深層次的探討等方面都具有重要意義[7]。

2 病證結合動物模型在研制思路上不斷創新

自20 世紀60 年代鄺安堃制備出首例中醫陽虛動物模型以來[8]，至今已有上百種證候動物模型建立[9]。單純的中醫證候造模多從病因入手，將中醫認為造成“證候”形成的原因施加于動物，以求造成與患者表現相同或相似的“證候”。然而，單純的中醫病因對于中醫病證來說多為誘發因素，而非直接發病因素，往往不具備特異性，與個體敏感程度、施加強度及作用時間等密切相關，因此模型的穩定性和代表性相對薄弱。西醫常規動物造模基于明確且特異的病理損害，其穩定性高、可重復性好，方法較為成熟，但缺乏中醫辨證思想，模型動物的病理狀態往往較難與中醫特定證候對等[10]。結合二者各自的特點及優勢，病證結合造模方法應運而生，其在研制思路上不斷進行創新與融合，具體如下文。

2.1 中西醫結合多因素復合造模

以中醫藥理論為基礎，結合現代醫學及實驗動物學相關知識，分別或同時采用中醫病因病機（如六淫、飲食、勞倦、情志等）復制證候模型，現代醫學病因復制疾病動物模型，使模型動物同時兼備疾病和證候的特征[11]。有研究[12]通過高糖高脂飼喂聯合游泳致力竭模擬中醫病因，聯合腹腔注射丁胺卡那霉素和鏈脲佐菌素模擬西醫病因，使模型大鼠符合2 型糖尿病脾腎氣虛證病證結合動物模型的評估標準。由于該模型可有效模擬臨床疾病與證候之間的病理對應關系，因此已廣泛作為研究載體進行臨床病理及證候本質的研究，并逐漸成為中藥新藥判定客觀療效和探討藥理作用的重要手段[13]。亦有學者[14]利用高脂飼養聯合冰柜冷藏，結合皮下注射腦垂體后葉素（pit），建立冠心病陽虛血瘀證大鼠模型，通過觀察動物整體活動表現及血脂、心肌酶、心電圖、心臟彩超等檢查，以及溫陽活血藥物干預進行反證，多環節論證模型與臨床的一致性。

2.2 西醫疾病模型基礎上探尋中醫證候

病與證候不可完全割裂看待，證候并非游離于疾病之外，也非施加中醫病因才出現中醫證候，而是在疾病發展過程中同時存在中醫證候的變化[15]。該模型是在西醫疾病模型的基礎上，未施加任何其他外在人為干預因素，在成模過程中或成模后，宏觀、微觀相結合，動態觀察并采集實驗動物癥狀、體征及實驗室指標，綜合分析并歸納疾病形成過程中“證候”的動態演變過程、特點，以及成模后所表現的中醫證型，從而確定某一特定的病證結合模型。有研究者[16]應用免疫造模法模擬人類免疫性血小板減少性紫癜，結果顯示模型符合由急性發病的熱證轉化為慢性發病的氣虛血瘀證的臨床實際情況。亦有相關研究[17]通過對自發性高血壓模型大鼠（SHR）早期中醫證候屬性進行行為學研究及宏觀表征觀察，發現SHR 早期中醫證候與人類高血壓肝火上炎證相似。還有研究[18]采用夾尾、禁食水、冰水強迫游泳、噪音刺激、限制行為等多種刺激類型，隨機安排建立抑郁癥大鼠模型，根據大鼠表征和行為學檢測判定為肝郁脾虛證型。

2.3 證候模型基礎上探尋西醫疾病類型

該模型建立首先依靠中醫傳統病因造模方式對動物進行初步環境因素模擬，通過觀察宏觀表征、檢測理化指標以及代表性方藥反證等方式，初步確立證候動物模型，在此前提下，尋找具有關聯性的臨床疾病進行驗證[19]。有研究[20]采用大黃煎煮液灌胃聯合夾尾、番瀉葉煎煮液聯合束縛的方法建立肝郁脾虛證候大鼠模型，通過比較大鼠造模前后體質量變化、給藥后排稀便時間等來評價該模型是否與現代醫學中的腸易激綜合征表現一致。

3 規范化與標準化問題仍面臨巨大挑戰

3.1 從多因素著手建立規范化病證結合動物模型

選擇何種動物進行人體病證的延伸模擬，是實驗研究的首要步驟。任何實驗動物都是研究過程中不可缺少的“最精密的實驗儀器”[21]，實驗動物的選擇與模型的制備關系密切，因此在制備過程中應盡量選擇與人體相似度高，對造模因素敏感性高，模型特征出現迅速、穩定且持久，同時易于滿足所研究病證相應特征的實驗動物[22]，以便于更好地模擬復制人類病證。例如，小型豬循環系統與人類相似，適宜于復制心血管相關病證[23-24]；大鼠及小鼠因易獲取、低成本、相關研究多、研究者熟悉程度高等因素，成為目前較為常用的造模動物。另外，同一證候模型造模動物選擇差異較大，如脾虛證模型制備選取動物有大鼠、小鼠、豚鼠等[25]。由于不同品系、不同性別實驗動物，對造模因素的耐受及敏感程度不同，同等強度作用于不同種系、不同生長階段的動物所造成的效果也不盡相同。這是模型可復制性相對較差的主要原因之一。因此，在縱向進行同一病證造模的同時，運用比較醫學的思想，橫向探索不同種系動物模型之間的相似度與差異性，從而篩選建立不同病證結合模型最適宜的造模動物選取標準。在進行相關病證結合動物模型系統評價時，可借鑒采用GRADE 對證據體進行分級評價，有利于提高臨床實踐與動物實驗結果相互印證的可行性[26]。

此外，病證結合動物模型并非憑空想象組合，所要構建的病證模型需在臨床上確有關聯，具有發展階段的同步性，同時需要滿足兩者的結合點易于發現，這樣才有可能作為深入探討病證結合機制的切入點進行研究，如臨床已證實冠心病與血瘀證的關系密切等。

造模因素的選擇對于構建規范化的病證結合動物模型也至關重要。目前，病證結合動物模型存在的主要問題是同一證候存在多種造模方法，如脾虛證模型造模因素中，中醫病因造模就包括苦寒瀉下、飲食失節、限制營養、耗氣等，若聯合現代醫學方法，采取單因素或復合因素方式構建，則種類更多，據統計可多達24 種[27]。目前尚缺乏何種造模因素能造出典型的符合臨床實際的中醫證型的相應規范。有鑒于此，可以結合臨床導致證候出現的主次原因，適當優化造模因素，使其同時符合中醫發病規律和臨床發病實際進程。同時，還可對同一證型的多種造模方法進行橫向比較，篩選建立最佳的構建模型的造模因素。

3.2 構建標準化評價體系至關重要

模型動物造模成功與否關鍵取決于對模型的評價。目前大多數病證結合動物模型缺乏合理的標準評價體系和方法。基于這種現狀，可以考慮從以下兩方面入手。

第一，宏觀表征與微觀指標對接，構建人與動物四診轉換模式。由于人與動物在解剖結構、生理病理等方面都存在一定的差異，因此證候轉換的問題不容忽視。一方面可以充分挖掘動物自身有助診斷的癥狀信息特點，尋找其與人的相似性，便于辨證分析；另一方面可以基于理論及臨床研究，總結一切能夠具體反映“證候”特點的生物標志物或宏觀表征，有機對接嵌構于動物模型評價體系中。目前已有相關研究在大鼠、小鼠和小型豬四診信息（半）客觀化方面取得一定的進展，如大鼠、小鼠四診工作站的建立可以實現定量化、標準化的采集和評價[28]。

第二，結合有效經典方藥反向驗證。利用方證相應理論，逆向應用“有是證用是方”治療思路進行反向驗證，通過用藥后癥狀、體征及相應實驗室指標的改善來證明模型動物的證候屬性。這可以進一步說明病證結合模型的科學性和合理性。

4 多學科交叉與大數據興起或將帶來機遇

4.1 從系統生物學尋找模型標志網絡

系統生物學是當前研究生命復雜系統較為公認的思維方式和研究手段，有利于揭示中醫證候的非線性復雜巨系統[29]。系統生物學通過整合多種組學信息，研究一個生物系統中的所有組分（如基因、mRNA、蛋白質及代謝物等）在特定條件下（如遺傳、環境因素改變等）的相互關系，進而實現從微觀基因、細胞、組織到宏觀個體的多方向、多層次研究，以解析生命復雜過程的本質規律[30-31]。系統生物學整合思想觀念與中醫“整體觀念”和“辨證論治”核心不謀而合，將其應用于探尋證候本質的研究，有可能從完整的疾病分子角度去詮釋證候的核心，幫助我們更好地理解證候實質，從而實現證候理論客觀化、定量化的科學詮釋，這也是中醫藥現代化、國際化發展的重要路徑。

單一組學在中醫證候研究領域的應用已較為廣泛，但仍需明確的是，組學本身并不能等同于系統生物學，而是要以系統模型為指向，結合生物信息學、系統控制等方法，針對證候的“外延”與“內涵”通過計算模型獲得規律性認識，從而產生與試驗結果相一致的系統模型[32]，否則單純的組學只不過是大規模的還原分析[33]。目前，已有相關中醫證候的網絡模型構建研究，如Li S 等[34]采用文獻挖掘、網絡分析及拓撲比較等方法，采用“相互作用-網絡-功能”研究策略，構建出基于“神經-內分泌-免疫”網絡相互作用下的中醫寒熱證網絡模型。這些網絡模型的構建可以有機建立起從人轉向動物模擬的生物學標志,為關鍵病理調控節點的發現提供線索，也為病證結合動物模型評價體系的構建做出貢獻。

表型組學（phenomics）[35]概念的提出也為證候的生物學基礎研究提供了新視角，幫助識別判斷證候所依賴的主觀癥狀的生物學基礎。這些研究將有助于科研工作者整體、全面地印證中醫證候動物模型的有效性及科學性，推進中醫理論的探索研究，深入“證候”本質[36]，在證候與生物學指標之間有機構建相對穩定的網絡，有助于闡明中醫證候與疾病的生物學關系。

4.2 現代科學技術交叉助力模型構建

有學者[37]提出，潛變量分析可以在分析過程中引入無法直接觀察、需經測量推斷的指標或變量，這與中醫證候的特點具有某些相似之處，因此有學者通過潛變量分析作為病證結合動物模型構建思路進行相關研究[38]。此外，Swanson教授提出一種基于非相關文獻知識發現的方法，可通過尋找隱藏關聯用于知識發現[39]。該方法可應用于兩類不相關的疾病文獻中尋找可能的相關因素，這與中醫“異病同治”思想存在一定的關聯。該方法可以應用于“方證相應”理論研究，挖掘同一方劑主治疾病譜存在的共同病理環節，并據此選擇典型的病因進行造模，使關鍵病理環節所致典型臨床特征得以在動物模型上實現。此外，貝葉斯網絡技術、復雜網絡和卡方自動交互檢測決策樹、決策函數、人工神經網絡等信息挖掘及人工智能手段也為更好地建立病證結合生物信息網絡，輔助動物模型的構建提供支持。

5 結語

盡管在病證結合動物模型領域已有諸多創新，并取得了一定的成果，但仍有許多問題尚待解決。尤其是規范化和標準化等問題，有賴于革新的技術手段和前沿的科學知識等諸多條件。因此，科研工作者要擺脫“一次成型”的思想。模型不能完全等同原型，只要能夠實現模擬原型實質并反映研究目的就是適合的模型，因此，在研制觀念上不應苛求每個模型都精準、全面、系統地覆蓋和表達臨床病例實體原型，畢竟病證在人體的表現形式也是千差萬別的。在評價體系的建立和完善過程中也應給予一定的時間，任何一種評價方法學的建立都需要在發展的過程中不斷去探索修正和改進完善，絕不可能一蹴而就。盡管病證結合動物模型之路道阻且長，但新知識、新技術的高速革新與更迭，一定能夠為其注入新的生機和活力，更有效地助力證候乃是中醫藥療效實質的揭示。