模式生物斑馬魚模型在方藥研究中的應用＊

岳勤霏，劉 默，范欣生＊＊，余 黎

（1. 南京中醫藥大學中醫學院·中西醫結合學院 南京 210023；2. 南京中醫藥大學藥學院 南京 210023）

斑馬魚又稱藍條魚、花條魚，原產于印度、孟加拉國等地，是一種常見的熱帶淡水魚，體型小，成魚體長4-6 cm，易飼養，繁殖能力強，四季產卵，產卵量大且為體外受精，體外發育[1]。斑馬魚模型與其他哺乳動物模型的生理、生化特征相似，與人類基因同源性達到87%[2]。其胚胎及幼苗早期光學透明，易于直觀觀察其特定生理病理變化，且便于實驗操作，可用于觀察藥物對復雜生命過程的影響。作為整體實驗動物模型，斑馬魚從整體水平評估藥物的治療效果及毒副作用，不僅篩選周期短，實驗費用低，易于操作觀察，且具有高效、快速、大規模的特點，是目前生命科學研究中重要的模式脊椎動物之一[1,3]。

斑馬魚模型應用于中醫藥研究，在毒理、活性成分篩選、藥效評價和代謝研究等方面發揮著重要作用。中藥或復方成分復雜，影響因素眾多，限制了細胞篩選體系和分子篩選體系的應用，特別是在以有效部位、提取物甚至水煎劑為研究對象時則更加困難[4]。斑馬魚給藥方式多樣，可以通過皮膚和腮吸收小分子化合物，受精72小時的斑馬魚也可以通過吞咽吸收藥物[1]，成魚也可通過插管灌胃給藥[3]，對于成分復雜的中藥樣品具有很好的適應性[5]，可用于中藥及復方等復雜成分體系的藥效評價及機制研究。基于以上優點，斑馬魚模型同樣適用于方劑配伍規律研究。目前，斑馬魚疾病模型涉及廣泛，包括血液疾病、心血管疾病、肌肉疾病、骨骼疾病、五官科疾病、傳染病以及腫瘤等[6]，用于抗炎與抗氧化損傷、調節血管新生、抗骨質疏松以及抗神經損傷等方藥的效應機制及配伍規律研究。

1 斑馬魚模型在方藥研究中的應用

1.1 抗炎與抗氧化損傷方藥研究

轉基因、誘導突變和反義morpholino knockdown及活體成像等技術的應用，使得斑馬魚模型成為研究炎癥免疫疾病相關的病理生理學的良好模式生物[4]，如Tg（coro1α:eGFP;lyz:Dsred）中性粒細胞與巨噬細胞雙標志轉基因斑馬魚[7]、巨噬細胞熒光轉基因斑馬魚(zlyz:egfp)[8]等基因型斑馬魚的建立。斑馬魚炎癥模型主要有細菌感染模型、病毒性感染模型、創傷性模型[7]以及硫酸銅溶液誘導模型。過氧化氫（H2O2）被廣泛用作誘導細胞和斑馬魚氧化損傷的氧化劑，研究表明，斑馬魚是研究H2O2誘導的氧化應激的可用模型[9，10]。

Zhou J等以脂多糖（LPS）建立斑馬魚炎癥模型，測量5 種炎癥細胞因子和6 種靶向蛋白的基因表達并進行脂質組學分析以鑒定潛在的脂質標記物以闡明黃連解毒湯（HLJDD）全面的抗炎活性機制。結果表明，HLJDD 改善了大多數脂類攝動，具有很強的抗炎功效。Toll 樣受體4/髓樣分化因子88 TLR4/MyD88 的激活在炎癥過程中起著至關重要的作用，而相應的脂蛋白（例如PLA2，SGMS 和SMDP）為脂質穩態與TLR4/MyD88 信號通路之間的重要中間體[11]。彭維兵等以硫酸銅溶液誘導巨噬細胞熒光轉基因斑馬魚炎癥模型，以斑馬魚側線炎癥病灶中巨噬細胞數量的影響評價昆海姜辛湯（褐藻多糖、昆布多糖、細辛脂素、姜辣素）及其組分配伍抗炎作用，結果表明昆海姜辛湯的合方組分配伍具有抗炎功效且寒熱組分配伍較寒寒配伍及熱熱配伍效應明顯[8]。杜婷婷等復制硫酸銅誘導中性粒細胞熒光斑馬魚炎癥模型，冰乙酸、佛波酯誘導AB 系斑馬魚外周、中樞疼痛模型，定量評價如意珍寶丸（沉香、珍珠母、香旱芹、石灰華等）的抗炎鎮痛療效，結果表明如意珍寶丸具有顯著的抗炎鎮痛作用[12]。Li L 等利用硫酸銅溶液誘導斑馬魚炎癥模型評價衢州枳殼提取物（QFAE）的抗炎活性，顯示QFAE 能減少炎癥部位的中性粒細胞數量，有明顯的抗炎作用[13]。Ji M 等以H2O2誘導的氧化損傷斑馬魚研究發現菊苣酸可以減少活性氧（ROS）和丙二醛（MDA）的產生，激活抗氧化酶超氧化物歧化酶（SOD）和谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）以及Kelch 樣環氧氯丙烷相關蛋白1/核因子E2 相關因子2/血紅素加氧酶1（Keap1/Nrf2/HO-1）抗氧化途徑，通過抗氧化而保護肝損傷[14]。

抗炎方藥藥效評價多應用轉基因斑馬魚，以中性粒細胞、巨噬細胞定量為主。因斑馬魚幼魚身體透明，可直接使用顯微鏡觀察，此種方法較為直觀可靠。同時，斑馬魚也可用于試劑盒檢測，許多哺乳動物類實驗動物氧化損傷相關指標，斑馬魚模型同樣適用，例如ROS、MDA、SOD 等。炎癥與氧化損傷是與許多人類疾病相關的復雜病理過程。許多疾病的發病機制與炎癥、氧化損傷密切相關，例如呼吸系統疾病哮喘、慢性阻塞性肺疾病以及特發性肺纖維化等。斑馬魚作為重要的模式脊椎動物之一，已經建立了成熟的炎癥以及氧化損傷模型，其應用對于深入研究方藥抗炎抗氧化作用機制以及配伍作用規律具有重要意義。

1.2 調節血管新生方藥研究

斑馬魚生長發育迅速，其心血管循環系統可在受精后48 小時完成發育，受精24 小時左右血液循環完成[15]。斑馬魚胚胎及幼體透明利于活體觀察。目前，研究中常用造模方式為VEGF 受體抑制劑（VRI）誘導、PTK87 誘導以及移植瘤等，以節間血管（SIV）以及腸下血管（SIVs）的生長情況等為觀測指標。內皮細胞標記綠色熒光轉基因斑馬魚Tg(fli-1:EGFP)、TG（VEGFR2:GFP）系血管熒光轉基因斑馬魚和Tg（kdrl:mCherry）轉基因斑馬魚常用于調節血管新生方藥研究當中。

LIN P 等研究表明當歸補血湯可促進血管新生，且黃芪∶當歸＝5∶1 時效果最佳，黃芪和黃芪甲苷Ⅳ的效果優于當歸和阿魏酸[16]。Hu F 等使用轉基因斑馬魚胚胎模型研究丹參葛根湯（丹參、葛根）的血管新生作用，結果表明該方增強了斑馬魚胚胎的腸下血管（SIVs）的萌發[17]。陳錫強等采用血管熒光標記轉基因斑馬魚胚胎研究西黃丸（牛黃、麝香、乳香、沒藥）及其組方藥味對斑馬魚節間血管形成的影響，結果顯示西黃丸中抑制血管生成作用與單味中藥材的活性密切相關，其中乳香與人工牛黃是發揮作用的主要藥味[18]。黃志軍等將熒光標記的人乳腺癌細胞移植入斑馬魚卵黃囊內建立移植瘤模型，評價小金膠囊（麝香、木鱉子、制草烏等）的抗腫瘤作用；用血管熒光Fli-1 系斑馬魚觀察其對新生血管形成的抑制作用，結果表明小金膠囊能誘導細胞凋亡，抑制MCF-7 移植瘤生長和新血管形成，具有潛在的抗腫瘤作用[19]。周忠焱、朱思行等采用VRI 誘導Tg(Fli-1:EGFP)轉基因斑馬魚建立血管損傷模型，結果表明通陽活血方（桂枝、三棱、莪術）、活血軟堅方（三棱、莪術、海藻、牡蠣）具有促血管新生的作用，其機制可能與其上調 VEGF 受體 VEGFR-1、2、3(flt1、kdr、kdrl)的表達有關[20，21]。Wang Y 等采用 Tg(fli-1a:EGFP)y1 轉基因斑馬魚研究得出鹽酸川芎嗪和芍藥甙通過劑量依賴性方式恢復VRI 誘導的斑馬魚血管不足，二者協同作用更佳[22]。

因評價方式單一，斑馬魚在調節血管新生方藥研究中以篩選優效方藥及機制研究為主，但配伍劑量比以及藥物協同作用也有研究。斑馬魚具有的獨特優勢使得其在發育與相關疾病研究領域應用廣泛，但目前對于機制研究并不深入。

1.3 抗骨質疏松方藥研究

斑馬魚是骨形成和骨吸收活動的完整體系[23]，骨骼結構和遺傳學與人類有高度的相似性，是用于研究骨骼變形和發育異常的成熟動物模型[24]。斑馬魚在抗骨質疏松藥物篩選中觀測指標有斑馬魚脊椎骨的熒光強度、魚骨膠原蛋白馬松染色、魚鱗片鈣、磷含量測定、堿性磷酸酶、羥脯氨酸含量測定[25]，骨礦化程度[26，27]等，主要以糖皮質激素地塞米松或潑尼松龍誘導建立斑馬魚骨質疏松模型。

尹恒、錢哲等以糖皮質激素建立斑馬魚骨質疏松模型，研究表明龜鹿二仙膠（鹿角、龜板、人參、枸杞子）對骨質疏松斑馬魚模型鱗片中鈣、磷含量均有上調作用，通過上調轉化生長因子β（TGF-β）/Smad信號通路的上游蛋白TGF-β1、TGF-β2 及下游蛋白Smad3來實現通路的激活，從而促進I型膠原蛋白的合成與分泌，調控核轉錄因子?B（NF-κB）和活化蛋白（AP-1）抑制炎癥反應以治療骨質疏松[28，29]；左歸丸（熟地黃、菟絲子、牛膝、龜板膠、鹿角膠、山藥、山茱萸、枸杞子）可通過逆轉骨形成/骨吸收的不平衡和激活TGF-β/Smad 信號通路來預防骨質疏松癥[30]。景莉君采用潑尼松龍誘導的斑馬魚骨質疏松模型，研究得出接骨湯具有促進骨生成、防止骨丟失作用[31]。譚登等以潑尼松龍建立斑馬魚骨質疏松模型，采用椎骨熒光面積、堿性磷酸酶（ALP）、骨形態發生蛋白2b（BMP-2b）、人類相關轉錄因子 2（Runx2）、組織蛋白酶K(CTSK)、抗酒石酸酸性磷酸酶5b（TRACP-5b）、活化T細胞的核因子，細胞質1（NFATC-1)基因表達水平評價了補腎通絡方（骨碎補、淫羊霍、白芍、茯苓、續斷、全蝎、蜈蚣、炙甘草）干預骨質疏松的效應并進行拆方研究。結果表明，補腎通絡方具有抗骨質疏松活性，且通絡方（全蝎、蜈蚣）可明顯改善骨質疏松，而補腎通絡方逆轉骨量流失的作用則更為顯著，與大鼠模型具有一致性[32]。蔣蓉等人采用對糖皮質激素復制斑馬魚骨質疏松模型，評價桃紅四物湯（桃仁、紅花、熟地黃、當歸、川芎、白芍）以及紅花主要成分羥基紅花黃A（HYA）的治療作用及其機制。結果表明，斑馬魚的骨礦化面積和累積光密度值有顯著性地升高,且呈劑量依賴性，ALP、I 型膠原蛋白 (type I)、Runx2、血清骨保護素(OPG)、TRACP-5b、骨鈣素(OCN)基因的表達也有明顯增加, Ca、P、K、Mg、Zn 和Fe 水平均顯著高于潑尼松龍組。桃紅四物湯通過增強成骨細胞活力,促進骨膠原表達和骨礦化，增加骨量，從而逆轉糖皮質激素性骨質疏松且其君藥紅花主要成分HYA 具有促進骨礦化, 提高成骨細胞活性的作用，說明紅花作為君藥在桃紅四物湯抗糖皮質激素性骨質疏松中發揮重要作用[33，34]。

斑馬魚骨質疏松模型的建立，既保持了在體動物的完整性，又克服了體外實驗作用環節單一，難以體現整體模型綜合效應的缺陷[35]。此外，有研究者提出基于斑馬魚模型采用M-Act/Tox 一體化評價（中藥的效應/毒性產生與其在體內的代謝轉化）高效篩選抗骨質疏松中藥。該方法是關注體內、外成分，兼顧有效性與安全性的抗骨質疏松篩選新方法[36，37]。斑馬魚模型在抗骨質疏松方藥研究中綜合展現了其高效、快速、大規模以及整體觀察的優勢，不僅有對復方的研究，也有對復方拆方以及主要成分的研究，以闡述方劑配伍特點，對中醫藥抗骨質疏松方藥研究具有一定的積極意義。

1.4 抗神經損傷方藥研究

斑馬魚的整個神經遞質系統包括膽堿能多巴胺能和去甲腎上腺素能通路已經被闡明，相比于其他無脊椎模型生物，斑馬魚出生后3 天就開始發育功能完好的血腦屏障[38]，且斑馬魚體型纖細，胚胎和幼魚時期透明，四天可形成完整的神經系統，在胚胎時期可觀察到成熟完整的中樞神經系統[39]，可通過特殊染色方法在完整的活體狀態下快速直觀檢測出神經系統的器質性損傷[40]。這些都說明了斑馬魚模型在神經系統疾病研究上的優勢。

王榮春等建立1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氫吡啶(MPTP)誘導的斑馬魚神經損傷模型，研究表明芪智消渴顆粒（黃芪、何首烏、益智仁、淫羊藿、雄蠶蛾、熟地、丹參、遠志、黃連等）能明顯逆轉MPTP 造成的游泳行為異常，提高斑馬魚的運動距離[41]。彭超寶等研究顯示桂枝甘草龍骨牡蠣湯類方對斑馬魚的運動行為有抑制作用，不同配伍對斑馬魚行為節律影響不同，其作用通路亦不盡相同[42]。Wang M 等建立6-羥基多巴胺誘導的神經損傷模型，結果表明谷精草提取物可以抑制6-羥基多巴胺在斑馬魚上引起多巴胺神經元減少，其作用機制可能與降低一氧化氮（NO）的產生和誘導型一氧化氮合酶（iNOS）的表達量有關[43]。李曉穩等蛋白組學分析斑馬魚神經元模型損傷藥物干預前后總蛋白差異，尋找養血清腦顆粒（當歸、川芎、鉤藤、白芍、夏枯草等）對斑馬魚神經元損傷預后的生物標記物及其作用機制，為養血清腦顆粒治療慢性腦供血不足篩選出預后標志物[44]。

目前，組學已經逐漸應用到斑馬魚模型當中，包括基因組學、蛋白組學以及代謝組學，從分子層面上揭示方藥多靶點多通路的復雜作用機制。

1.5 其他

除以上研究之外，斑馬魚模型還用于腦出血、脂質代謝、色素研究等方面。如李瀟等以辛伐他汀誘導黑色素等位基因突變型Albino 品系斑馬魚建立腦出血模型，探索健脾益氣攝血方（黨參、白術、茯苓、炙甘草、黃芪、阿膠、茜草）及其拆方的防治效果，得出健脾方（黨參、白術、茯苓、炙甘草）和健脾益氣方（黨參、白術、茯苓、炙甘草、黃芪）對辛伐他汀誘導斑馬魚腦出血無防治效果；健脾益氣生血方（黨參、白術、茯苓、炙甘草、黃芪、阿膠）與健脾益氣攝血方顯示有良好防治效果，但高濃度具有毒性[45]。肖紅彥以肥胖斑馬魚為模型，從多方面證實地黃提取物可有效抑制斑馬魚的肥胖[46]。韓冰研究表明小檗胺對高血脂斑馬魚具有較好的降血脂效果，其分子機制可能是抑制膽固醇的合成和脂蛋白的組裝分泌，促進膽固醇的轉運和轉化[47]。王天晶研究表明菟絲子水提物對斑馬魚黑素細胞黑色素合成有抑制作用，且斑馬魚模型與其它模型具有較好的一致性[48]。

2 展望

斑馬魚幼魚是目前為止唯一適合高內涵、高通量、微孔板的脊椎動物模型，適用于中藥復雜成分體系，既用于中藥物質成分、提取物的研究，也用于單味藥、復方研究，在方藥研究中的應用逐漸深入。方劑研究是方藥研究的重要組成部分，而配伍是方劑的重要環節。上述內容表明斑馬魚模型也可應用于方劑配伍規律研究當中。斑馬魚模型可在應用于方藥效應評價和機制研究的基礎上，篩選方藥活性成分，分析方劑組方配伍特點，探討方劑最佳藥物組成配比等。此外，代謝組學、蛋白質組學等也應用到斑馬魚模型當中，使得模式動物斑馬魚在方藥研究中的應用更加豐富和深入。斑馬魚模型也有局限性，例如斑馬魚給藥方式以及藥物吸收方式與人或其他哺乳類動物模型存在差異，一定程度上可能影響藥物效應評價結果；斑馬魚研究方法、檢測指標較其他動物模型少，可用的抗體較少，蛋白水平研究存在一定困難。目前，盡管許多方藥通過建立斑馬魚模型證實其藥效，但研究結果多數局限于相應的效應指標，而對于單體、提取物、復方的作用機制研究尚不深入，需進一步探索。

綜上，斑馬魚作為低成本、高效、快速的實驗動物模型，理應在中醫藥發展中充分利用。斑馬魚生物模式處于發展階段，斑馬魚模型開展中藥復方的研究逐漸增多。結合傳統中醫藥理論、臨床實踐及現代研究進展，未來應用斑馬魚模式生物開展方藥配伍規律、劑量關系等研究將是中醫藥研究的方向之一，對指導中醫臨床用藥具有重要作用。