病證結合動物模型研究進展＊

彭紫凝 ，邢玉鳳 ，龐欣欣 ，張雅歌 ，石秀杰 ，韓佳瑞 ，

（1. 河南中醫藥大學第二臨床醫學院 鄭州 450046；2. 河南省中醫院/河南中醫藥大學第二附屬醫院 鄭州450002）

在現代醫學的研究中，需要通過動物實驗來驗證臨床思路、探索新穎的治療方法，而動物模型是完整的動物實驗中不可或缺的重要基礎[1-2]。目前，研究者所建立的大部分動物模型僅以西醫的疾病模型為主要參考，整個研究過程中醫理論指導與中醫證候因素均不能夠很好的體現[1]。而換一種方案，建立單純的中醫證候模型只是簡單的借鑒中醫藥的理論方法，一個“證”又對應的不止一種疾病，對模型的建立不具有特異性，且重復性較差[3]。因此，迫切需要一種不僅能反映“病”而且能體現出“證”的動物模型，許多研究者就這一問題進行深入研究，提出了病證結合的動物模型的概念。

病證結合動物模型的建立，是將現代醫學科學中，西醫所確定的疾病復制在動物身上，同時利用中醫理論指導，將中醫的證候復制到動物模型上，使研究的模型既具有了西醫疾病特點，又具有了中醫證候特點，比單純疾病模型或者單純證候模型具有更強的說服力，從而使醫學科學研究更具有針對性，更好地將微觀與宏觀、抽象與具體整合[4]。隨著現代醫學對病證結合動物模型的研究不斷深入，取得了相當多的研究成果，本研究就近年來關于病證結合動物模型的研究成果進展進行綜述。

1 關于病證結合動物模型的構建要點

構建病證結合動物模型：第一，應重視中醫理論指導，模型應充分體現中醫理論對研究方向的疾病和證候的影響，如外傷血瘀證動物模型，其原理是根據《黃帝內經》“若有所墮墜、惡疝，在內而不去……則氣血凝結”的論述，應用杠桿擠壓法，構建外傷血瘀證模型[5]。第二，疾病模型與證候之間應當密切關聯，如糖尿病腎病與氣陰兩虛證密切相關，腦卒中最常見氣虛血瘀證，類風濕關節炎最易建立風寒濕痹證，等等。第三，根據研究疾病的不同，應選擇最合適的動物，即與人體疾病變化規律盡可能相似的動物，如與內分泌失調有關的疾病的研究，常選用大鼠，因為較其他動物而言，大鼠內分泌腺最容易摘除；由于兔子容易產生發熱的反應，最方便制作有關發熱的動物模型等[4]。第四，要選擇特異性強、重現性好、定量或半定量的指標作為造模評價標準，以挖掘動物身上帶有符合中醫臨床辨證診斷標準的特征。如制備冠心病的寒凝心脈證動物模型，可通過觀察大鼠體征，配合心臟彩超、血液流變學等指標來判定。下文將舉例說明幾種近年來研究較多且疾病發病率較高的病證結合動物模型。

1.1 糖尿病腎病病證結合的動物模型

糖尿病腎病是臨床常見的代謝性疾病，是終末期腎病的重要原因，大約35%～40%的1 型或2 型糖尿病患者會發展為糖尿病腎病，增加了心血管疾病的發病率和死亡率[6]?，F階段,西醫治療糖尿病腎病大多是在飲食調整的基礎上,采用降糖降壓、調節代謝紊亂等一系列治療方法,療效一般。中醫認為，糖尿病腎病屬于“消渴”“水腫”等范疇，其多氣虛、血瘀、陰虛、陽虛、濕濁等證型[7]，辨證施治與西醫治療結合可取得較好臨床療效。因此，構建良好的病證結合動物模型對中西醫結合治療糖尿病腎病的研究必不可少。

目前，研究者制備糖尿病腎病動物模型，往往是通過予以大鼠高脂飼料和小劑量腹腔注射鏈脲佐菌素（STZ），成功制備2 型糖尿病腎病模型。胡愛民等[8]制備2 型糖尿病腎病模型后，采用饑飽失常、過度疲勞、恒溫水槽中游泳、驚嚇等方法制備氣陰兩虛證型，通過大鼠行為表現、腎臟病理變化、體液檢驗及中藥反證法來驗證制備成功。孫紅旭等[9]成功誘導糖尿病腎病模型后，再給予大鼠腺嘌呤和苦寒中藥混合灌服，制備脾腎陽虛的中醫證型，通過大鼠行為表現、腎臟病理變化、體液檢驗來證實成功制備模型。樊少儀等[10]制備動物模型符合糖尿病腎病制備的標準后，通過疲勞游泳法制備氣虛型糖尿病腎病病證結合模型，主要通過大鼠行為表現、腎臟病理變化、體液檢驗及游泳時間來驗證制備成功。從上述研究結果表明，臨床上，糖尿病腎病的證候較為復雜，多虛實夾雜,而已有的病證結合模型仍較為單一，建立證候模型理論依據不夠充分，驗證證候模型沒有相應的理化指標檢測，干預藥物沒有統一標準，評價行為表現尚未統一，等等，這些問題仍然需要進一步研究來解決。

1.2 冠心病病證結合的動物模型

目前，我國因心血管病死亡人數占總死亡人數的40%，死亡率遠超于其他疾病，其中冠狀動脈粥樣硬化性心臟?。ê喎Q冠心病）人數已經高達1100 萬[11]。隨著社會發展和人們生活方式的變化，冠心病逐漸成為威脅人類健康的重大疾病之一[12]。雖然現代醫學在冠心病的二級預防、冠狀動脈旁路移植術等治療方法上已經取得顯著進展，但是仍然存在很多問題，如介入術后胸悶胸痛癥狀仍明顯，部分人對冠心病二級預防的藥物不耐受等，中醫藥治療則可以很好的緩解以上癥狀[13]。因此，針對冠心病的中西醫結合治療已經刻不容緩，而科學的建立病證結合的動物模型也是進一步研究冠心病治療方法的關鍵。

王朔等[14]采用冠狀動脈左前降支結扎法聯合高脂飼料喂養C57BL/6J 雄性小鼠建立冠心病痰瘀互結證動物模型，通過模擬心肌缺血復合動脈粥樣硬化的病理特征，確定該模型制備成功。周晟芳等[15]根據“恐傷腎”以及“寒凝血瘀”中醫理論，對Wistar大鼠采取驚嚇同時使其處在寒冷環境的方法，皮下注射激素氫化可的松，再通過結扎大鼠冠狀動脈的前降支，復合建立心肌缺血型的冠心病腎虛血瘀的病證結合的模型，通過大鼠體征、生化檢驗、心電圖等來確定造模成功。黃爍等[16]采取讓Wistar 雄性大鼠疲勞跑步運動，同時給予其左冠狀動脈前降支行高位結扎的方法，觀察心電圖、大鼠體征、超聲心動圖、行為習慣、心臟病理檢驗等指標，表明已建立冠心病氣虛血瘀證病證結合模型。目前，對于如何檢驗臨床冠心病一些證型，已經初步有一系列方法及標準，例如，心電圖對瘀血陽微證、心肺氣虛證和氣陰兩虛證有診斷意義，心臟X 線對氣陰兩虛證、心肺氣虛證、氣滯痰阻證和陽虛氣滯證有診斷意義，等等[17]，但是對于建立動物模型尚未有完整研究，且這些臨床檢驗指標大部分不適用于動物模型，因此，仍需要進一步深入研究。

1.3 哮喘的病證結合的動物模型

支氣管哮喘（簡稱哮喘）是臨床中較為常見的慢性呼吸道疾病，臨床主要表現為反復發作性的胸悶咳嗽、氣喘，病情遷延難愈[18]。哮喘在目前臨床上治療方法以吸入性糖皮質激素為主，但治療效果有限[19]。中醫認為，哮喘常見的證型是肺虛、肺腎兩虛、肺脾兩虛等[20]，治療上不僅可以改善癥狀，減輕西藥依賴性,還可以減少哮喘的急性發作次數。因此，建立病證結合哮喘模型為促進中西醫結合治療哮喘的發展奠定堅實的研究基礎。

厲蓓等[21]使用Balb/c 雄性小鼠，采用卵蛋白反復激發法建立肺氣虛哮喘模型，在此基礎上，基于“恐傷腎”原理用C57BL/6J 小鼠作為攻擊者模擬社交應激，通過哮喘相關理化指標判定成功建立肺腎氣虛哮喘動物模型。王志旺等[22]用皮下注射致敏液的方法激發小鼠哮喘，成模后對小鼠灌胃甲狀腺片溶解物，檢測小鼠肺通氣功能以及肺組織哮喘相關蛋白表達等指標，成功建立陰虛哮喘病證結合動物模型。嵇冰等[23]制備模型時采用氫化可的松注射液皮下注射及卵清白蛋白致敏法，通過大鼠行為表現、體征、體液檢驗、生化檢驗、肺組織病理等一系列指標驗證，證實腎陽虛證支氣管哮喘的病證結合動物模型建立成功。關于哮喘病證結合動物模型的研究日漸增多，但是不同研究者對其認識不一，導致病證結合動物模型研究良莠不齊。研究者構建哮喘動物模型時，致敏因素不夠確定，不同的致敏因素效果不同，也無法確定是否影響到其他指標，并且研究者對動物的行為觀察，如噴嚏、咳嗽等，具有很大程度的主觀性，研究者檢測的指標也不夠統一完善。

1.4 類風濕性關節炎的病證結合動物模型

類風濕關節炎是一種以慢性關節滑膜炎為主的系統性疾病，其致殘率極高，已經嚴重影響到患者的生存質量[24]。類風濕性關節炎在中醫上屬于“痹癥”范疇。目前，臨床上的主要治療藥物多以西藥為主，雖效果明顯，但是毒副作用較大，而中醫藥治療療效持久，因此中西醫結合治療也許是最有效的治療方法[25]。由于臨床證候研究中存在諸多未知因素，需要構建合適的病證結合動物模型來深入研究。

蘇杉等[26]對SD 大鼠皮內注射Ⅱ型膠原乳劑并用改裝后的智能人工氣候箱和冰水刺激施加風寒濕刺激制備風寒濕類風濕關節炎大鼠模型，通過對比大鼠足跖腫脹度、血清檢測指標、AI評分等各項指標，判定成功建立風寒濕痹類風濕關節炎病證結合動物模型。趙宏艷等[27]先用羥基脲法和去勢法制備大鼠腎虛模型和利血平法制備大鼠脾虛模型，后采用注射Ⅱ型膠原法制備類風濕關節炎模型，成功后檢測類風濕關節炎相關指標，確定成功構建腎虛證與脾虛證類風濕關節炎病證結合動物模型。王蓉等[28]對SD 大鼠皮內注射Ⅱ型膠原乳劑制備類風濕關節炎大鼠模型，再把大鼠放入人工氣候箱進行風濕熱模型構建，通過觀察大鼠一般情況及檢測相關指標，證實成功建立風濕熱痹類風濕性關節炎。目前，類風濕性關節炎動物模型僅模擬了患者的部分特征，其他多系統病變如晨僵、關節壓痛等不適很難體現出來，仍有很大局限性。

1.5 其他病證結合動物模型

除了上述幾種研究較多、發病率較高的疾病外，研究者還研究了其他疾病相關的病證結合動物模型。例如，陳奔等[29]在樹鼩雙側腦室注射混合溶液，并在其腹腔注射角叉菜膠溶液，通過觀察樹鼩的一般情況，檢測癡呆和血瘀相關指標，證實血瘀證病證結合癡呆模型制備成功。楊新鳴等[30]采用細菌內毒素腹腔注射法聯合來曲唑灌胃法構建腎虛血瘀型多囊卵巢綜合征病證結合大鼠模型，并通過觀察大鼠一般行為活動及檢測相關血清指標等驗證模型建立成功。郭軍雄等[31]采用番瀉葉灌服法聯合慢性束縛應激法建立了腹瀉型腸易激綜合征“肝郁脾虛證”大鼠模型，通過觀察大鼠行為及檢測與胃腸道相關的血清等指標證實該模型制備成功。

綜上所述，現階段病證結合模型的構建大多數是在現代疾病造模的基礎上，通過符合中醫病因理論的外部刺激、飲食、藥物等因素刺激，多種因素疊加制作而成。但這些造模方法存在缺乏統一性、可操作性及重復性差等不能回避的問題，有待進一步研究解決。

2 關于病證結合動物模型的評價

病證結合的動物模型的評價，應是研究的重點部分，不僅包括西醫“病”的評價，還包含中醫“證”的評價。在現代科學研究的動物模型中，西醫疾病的判定已較為成熟，在此不做詳細贅述，但是現階段中醫證候屬性的評價判定，仍然存在一定的不確定性，因此建立病證結合的動物模型，證候屬性的判定應是核心環節[32]，目前研究模型評價多從以下幾個方面來判定。

2.1 從動物模型的宏觀體征及行為表現來判定

買鵬宇等[33]通過多因素復合法建立濕熱挾瘀證自身免疫性前列腺炎KM 小鼠模型，依據小鼠精神萎靡懶動、飲食飲水減少、毛發少光澤、舌體暗紅和大便溏稀等證候評價，判定濕熱挾瘀證模型構建成功。曾梅艷等[34]建立脾胃虛寒型十二指腸潰瘍大鼠模型，模型大鼠不僅飲食、飲水量減少，出現倦怠，行動呆滯，大便溏瀉等體征，更是出現明顯毛發疏松粗糙甚至豎立發黃，大便溏瀉、肛門污穢等現象，接近于中醫脾胃虛寒型十二指腸潰瘍征象。目前，中醫證候的判斷大多依據臨床指南或專家共識，如血瘀證冠心病參考《冠心病及急性心肌梗死中醫臨床辨證標準及防治指南》規定，血瘀證辨證要點為胸痛，痛有定處，舌質紫黯，或有瘀點、瘀斑[35]。在患者身上，這些證候屬性最為直接，但是在動物模型上，臨床的四診信息也很難一一體現。此外，研究者主觀推定的診斷信息也存在不確定性，且不易量化，故據此判定動物模型的證候往往證據不足[32]。

2.2 從一些與證候相關的理化指標判定

研究者采用理化指標來判定，通過檢測與構建證型相關聯的一些指標，側面證實模型建立成功，如郭文鶴等[36]用血液流變學、凝血功能、升主動脈和肝組織的病理學等指標，來衡量氣滯血瘀證動脈粥樣硬化病證結合大鼠模型是否構建成功。雖然目前研究者找到了一些與證候相關的理化指標，但是大多數與血瘀型有關，至于氣虛、痰濁、陽虛等證型，尚未發現可信度高的相關理化指標。已經確定的一些與證候相關的理化指標，特異性也不夠，不能作為確定證候診斷的明確指標，無法證明這些指標的外在表現與患者外在證候是一致的。因此，以此來判定模型的證候屬性，同樣存在缺陷。

2.3 從中藥藥物的反證法來判定

中藥藥物的反證法即以方測證，是通過選擇臨床上常用且療效明顯的經典方藥，來反證造模成功。如郭春榮等[37]通過檢測金匱腎氣湯對大鼠有治療效果而六味地黃湯不僅沒有效果反而加重哮喘，反證腎陽虛哮喘大鼠模型建立成功；李依潔等[38]建立脾腎陽虛型腸易激綜合征的病證結合的動物模型，給予溫腎健脾方反證，大鼠行為表現及體征指標改善。研究者通過比較干預前、后一些較為特異性的檢測指標，來反推此模型屬于哪一種證型。依據方劑反測其證候屬性，這種方法極具有中醫特色，但是仍存在一些問題：首先，反證法不具有特異性，中藥湯劑相對中醫的證并沒有一對一的關系，藥物反證無效也不能證明完全不對證，藥物有效也可能是相似證；其次，是反證法所采用的經典方藥沒有統一參考標準，研究者自圓其說；最后，以方測證過程的謹慎性與嚴密性也不夠。因此，目前大多數的研究只是把該反證法作為佐證。

2.4 從造模的因素推測判定

認定證候屬性也可以從病因角度推測。黃正團等[39]基于“恐傷腎”原理用夾尾恐嚇法建立腎虛證病證結合模型；于春月等[40]建立氣虛血瘀型慢性萎縮性胃炎的病證結合的動物模型，采用N-甲基-N＇-硝基-亞硝基胍、雷尼替丁飼料、水楊酸鈉和饑飽失常四個因素綜合造模法，可以制備氣虛血瘀動物模型。審因測證，即從中醫的病因來直接推測其證候的屬性，同樣存在一定的弊端：一方面缺乏肯定的證候診斷方法，另一方面同樣的致病因素有可能出現不一樣的中醫證候，影響了判定模型證候應具備的唯一性。

大部分研究者對病證結合的動物模型的評價標準仍然主要通過以上四種方法，模型評價方面目前仍存在較多的問題：第一，混合雜亂的造模因素不完全是中醫臨床上常見的病因；第二，動物模型癥狀和體征的采集方式和評價不夠完善；第三，客觀指標和中醫的證候沒有密切的聯系；第四，以方測證存在方法學重要缺陷[41]。本研究認為，病證結合的評價，應當不僅僅從單一的以上四種方法，還要疊加以上要素，力求每一個造的病證結合動物模型，在宏觀體征及行為表現、一些與證候相關的理化指標、從造模因素推測判定方面均符合造模評價，并且能夠從中藥藥物方面反證。但具體的評價的度，以及如何判定該要素是否可以或足夠作為病證結合動物模型的評價標準，仍然是未來待突破的問題。

3 病證結合動物模型的應用

目前，病證結合動物模型已廣泛應用于各種疾病的研究中，能較好體現中醫辨證論治的思想，其主要應用于以下五個方面：①用于研究證型與疾病之間的關系，如肺腎氣虛證型可以加重哮喘，哮喘的發生也多伴有肺氣虛等；②探究不同病因對不同疾病及證型的影響，如研究寒冷氣溫刺激對動物患寒凝血瘀型冠心病的影響；③還可用于研究疾病的各種治療方法的療效評價，如推拿和活血化瘀藥均可以緩解血瘀證，但是推拿可能更易于緩解局部血瘀而用藥傾向于緩解全身等；④病證結合動物模型能夠較好地模擬臨床患者的證型，研究者可以擇選出最佳方劑干預該疾病和證型；⑤可用于病證毒理學的研究。

病證毒理學研究多采用正常動物來探究藥物量-時-毒關系，如有研究者探索不同濃度的加減當歸芍藥湯對正常小鼠的最大耐受量[42]，病證結合模型可能為中藥病證毒理學提供新的方向，探索不同證型下中藥及中西醫結合用藥的安全性，促進精準用藥的發展，降低臨床上藥源性疾病風險[43-44]。

4 思考與展望

目前，如何構建病證結合的動物模型，以及準確對其進行評價的研究還處于探索階段，問題仍然較多：①現階段制備模型時采用中醫病因造模較少，大多數都采取西醫疾病病理概念造模；②研究者在采用單因素造模時，雖然可以較好的確定單個病因對應單個證型，但是模型與現實疾病的復雜性不相符。然而，在采用多種因素造模時，這些因素之間的相互關聯性難以證實，變量過多，可重復性差，并且中醫西醫因素混合，缺乏邏輯性；③現階段造模的評價方法尚缺乏量化的標準，不能夠準確的評價造模是否成功，其中分為兩類：一類是證候可通過理化指標來判定，但是判定標準不明確，如血瘀證可通過血液流變學等指標檢測，測定指標類型與判定標準尚未完全確定；另一類是暫未找到合適的理化指標，只能通過較為主觀的一些評判標準，如肝郁脾虛證大多數只能通過動物行為觀察及稀便來判定；④中醫病證結合模型的可重復性較差，不如西醫病理模型具備定量復制的優點，而且模型質量的穩定性等也有待提高；⑤現代醫學中醫證候的診斷標準正在不斷完善，但是現階段病證結合所制備的動物模型并不能夠與臨床病證完全吻合，因此模型只能模擬反映臨床疾病的一部分，而反映的這部分也不是百分百定量確定的；⑥在以方測證時，研究者對選用的經典方也口徑不一，目前尚未確定如何選擇最合適的方藥來對模型進行驗證，使模型制備更符合臨床標準。

值得慶幸的是，致力于科研與臨床的研究者對不同病證結合的動物模型的造模方法，仍在不斷對比、篩選及優化。更有研究者致力于構建集系統性與嚴謹性于一體的病證結合的動物模型和評價體系。眾多研究者期待隨著現代醫學對中醫藥研究的逐步完善與深刻挖掘，在現有研究成果的基礎上，病證結合動物模型必然能使中醫藥體系長足發展，在未來更上一層樓。