HPLC-DAD-ELSD法測定黃芪經(jīng)九州蟲草雙向固體發(fā)酵前后8種成分的含量

杜以晴 于欽輝 文冉 菅彤彤 容蓉 呂青濤 張國英

摘 要 目的：建立同時(shí)測定黃芪經(jīng)九州蟲草雙向固體發(fā)酵前后毛蕊異黃酮苷、芒柄花苷、毛蕊異黃酮、芒柄花素、黃芪皂苷Ⅳ、異黃芪皂苷Ⅱ、環(huán)黃芪醇、異黃芪皂苷Ⅰ等8種成分含量的方法，并探討發(fā)酵處理對黃芪中上述8種成分含量的影響。方法：采用高效液相色譜-二極管陣列檢測器-蒸發(fā)光檢測器聯(lián)用技術(shù)（HPLC-DAD-ELSD）進(jìn)行含量測定。色譜柱為Agilent 5 TC-C18;流動相為0.1%甲酸水溶液（A）-乙腈（B），梯度洗脫;流速為1 mL/min;柱溫為30 ℃;DAD檢測波長為260 nm;ELSD蒸發(fā)管溫度為100 ℃;霧化器溫度為80 ℃;載氣流速為1.6 L/min;進(jìn)樣量為15 μL。結(jié)果：8種成分在各自質(zhì)量濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好（R2均大于0.999 0）;精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性試驗(yàn)的RSD均小于3%（n=3或n=6）;平均加樣回收率為97.88%～101.32%，RSD為1.22%～2.39%（n=6）。以未發(fā)酵黃芪中相應(yīng)成分含量為100%計(jì)算，經(jīng)九州蟲草雙向固體發(fā)酵后，黃芪中毛蕊異黃酮苷、芒柄花苷、毛蕊異黃酮、芒柄花素、黃芪皂苷Ⅳ、異黃芪皂苷Ⅱ、環(huán)黃芪醇、異黃芪皂苷Ⅰ的含量變化率分別為-98.51%、-96.41%、-94.74%、 ?-96.40%、289.20%、20.25%、-75.05%、562.46%。結(jié)論：黃芪經(jīng)過九州蟲草發(fā)酵后，有利于增加其主要活性成分黃芪皂苷Ⅳ、異黃芪皂苷Ⅰ、異黃芪皂苷Ⅱ的含量。

關(guān)鍵詞 黃芪;九州蟲草;雙向固體發(fā)酵;高效液相色譜-二極管陣列檢測器-蒸發(fā)光檢測器聯(lián)用技術(shù);含量測定

ABSTRACT OBJECTIVE： To establish a method for simultaneous determination of calycosin glucoside， ononin， calycosin， formononetin， astragaloside Ⅳ， isoastragaloside Ⅱ， cycloastragenol and isoastragaloside Ⅰ in Astragalus membranaceus before and after bidirectional solid fermentation with Cordyceps kyushuensis， and to investigate the effects of fermentation on the contents of above 8 components in A. membranaceus. METHODS： HPLC-DAD-ELSD was adopted. The determination was performed on Agilent 5 TC-C18 column with mobile phase consisted of 0.1% formic acid aqueous solution-acetonitrile （gradient elution） at the flow rate of 1 mL/min. The column temperature was set at 30 ℃. DAD detection wavelength was set at 260 nm， ELSD evaporation tube temperature was 100 ℃， atomizer temperature was 80 ℃， carrier gas flow rate was 1.6 L/min; injection volume was 15 μL. RESULTS： The eight components had a good linear relationship within their respective ranges of concentration （all R2>0.999 0）; RSDs of precision， stability and repeatability tests were all less than 3% （n=3 or n=6）; the recoveries was 97.88%-101.32%， and RSDs were 1.22%-2.39% （n=6）. Setting the content of components in unfermented A. membranaceus as 100%， after bidirectional solid fermentation with C. kyushuensis， the change rates of 8 components were -98.51%，-96.41%， -94.74%， ? ?-96.40%， 289.20%， 20.25%， -75.05%， 562.46%， respectively. CONCLUSIONS： After fermentation with C. kyushuensis， the contents of active components as astragaloside Ⅳ， isoastragaloside Ⅰ and isoastragaloside Ⅱ can be increased significantly in ? ? ? ?A. membranaceus.

KEYWORDS Astragalus membranaceus; Cordyceps kyushuensis; Bidirectional solid fermentation; HPLC-DAD-ELSD; Content determination

黃芪為豆科植物蒙古黃芪Astragalus membranaceus（Fisch.）Bge. var. mongholicus（Bge.）Hsiao 或膜莢黃芪Astragalus membranaceus（Fisch.）Bge.的干燥根[1]，是傳統(tǒng)補(bǔ)氣要藥之一。黃芪含有皂苷類、黃酮類、多糖類和氨基酸類等有效成分[2]，具有增強(qiáng)免疫功能、保護(hù)心臟、雙向調(diào)節(jié)血壓、降血糖、抗衰老、抗腫瘤、抗病毒、抗過敏性鼻炎和保護(hù)神經(jīng)等作用[3-4]，在臨床上廣泛應(yīng)用于治療病毒性心肌炎、糖尿病、肝纖維化、腫瘤、上呼吸道感染等病癥[5]。

九州蟲草Cordyceps kyushuensis Kob為寄生于豆天蛾Clanis bilineata Walker幼蟲體上的蟲草真菌[6]，具有良好的清除羥基自由基和超氧陰離子自由基的能力，其抗氧化性能與冬蟲夏草基本相當(dāng)[7-8]，且其不同提取物對非小細(xì)胞肺癌、人白血病細(xì)胞株U937、HL-60以及人肝癌細(xì)胞株Bel-7402等均有顯著的抑瘤作用[9-11]，呈現(xiàn)出良好的抗腫瘤藥用前景。雙向固體發(fā)酵是將傳統(tǒng)中藥與現(xiàn)代生物技術(shù)的優(yōu)勢相結(jié)合，使用中藥材作為藥性基質(zhì)取代或添加至真菌培養(yǎng)基，藥性基質(zhì)與真菌相互作用，基質(zhì)提供真菌發(fā)酵過程中所需的營養(yǎng)成分，真菌在中藥材所含活性成分基礎(chǔ)上通過發(fā)酵產(chǎn)生新的成分，可提高中藥藥效、產(chǎn)生新的性味和功能、降低毒副作用[12-13]。例如，板藍(lán)根經(jīng)槐耳真菌雙向固體發(fā)酵后的發(fā)酵物被證實(shí)具有抑制腫瘤細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移的作用[14]。

本課題組前期研究已證實(shí)，將具有抗腫瘤活性的九州蟲草真菌與具有類似或協(xié)同作用的抗癌中藥黃芪共同進(jìn)行發(fā)酵后，發(fā)酵黃芪對非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞A549生長和增殖的抑制作用顯著增強(qiáng)。為探討黃芪經(jīng)九州蟲草雙向固體發(fā)酵前后的主要化學(xué)成分的變化，本研究選擇黃芪中4種主要黃酮類成分（毛蕊異黃酮苷、芒柄花苷、毛蕊異黃酮、芒柄花素）及4種主要皂苷類成分（黃芪皂苷Ⅳ、異黃芪皂苷Ⅱ、環(huán)黃芪醇、異黃芪皂苷Ⅰ）為考察指標(biāo)，采用高效液相色譜-二極管陣列檢測器-蒸發(fā)光檢測器（HPLC-DAD-ELSD）聯(lián)用技術(shù)檢測黃芪經(jīng)九州蟲草雙向固體發(fā)酵前后8種成分的含量，用于研究九州蟲草雙向固體發(fā)酵對黃芪化學(xué)成分的影響，為闡明黃芪-九州蟲草雙向固體發(fā)酵的作用機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 儀器

R-300EL型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀[瑞士Buchi實(shí)驗(yàn)室設(shè)備貿(mào)易（上海）有限公司];1260 InfinityⅡ型HPLC儀（美國Agilent公司）;116B型搖擺式高速中藥粉碎機(jī)（瑞安市永歷制藥機(jī)械有限公司）;KQ-500DE型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）;AE240型十萬分之一電子天平（瑞士Mettler Toledo公司）。

1.2 藥品與試劑

黃芪藥材購自山東省濟(jì)南市建聯(lián)大藥房（批號：20181001），經(jīng)山東中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院李峰教授鑒定為蒙古黃芪A. membranaceus（Fisch.）Bge. var的干燥根;毛蕊異黃酮苷對照品 （批號：M-020-170926）、芒柄花苷對照品（批號：M-013-160906）、毛蕊異黃酮對照品（批號：M-021-170517）、芒柄花素對照品（批號：C-018- 160304）、黃芪皂苷Ⅳ對照品（批號：H-045-160721）、異黃芪皂苷Ⅱ?qū)φ掌罚ㄅ枺篩-139-171012）、環(huán)黃芪醇對照品（批號：H-051-170426）、異黃芪皂苷Ⅰ對照品（批號：Y-137-171011）均購自成都瑞芬思生物科技有限公司，純度均大于98%;乙腈為色譜純，其余試劑均為分析純或?qū)嶒?yàn)室常用規(guī)格，水為實(shí)驗(yàn)室自制超純水。

1.3 菌種

野生九州蟲草采自山東蒙山天麻林場，由中科院北京微生物研究所郭英蘭研究員鑒定其無性型菌株為九州輪枝菌;人工九州蟲草系由無性型菌株回接人工固體培養(yǎng)基栽培后獲得，九州蟲草菌絲體系無性型菌株液體培養(yǎng)獲得，由山東大學(xué)微生物技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供。本研究中九州蟲草菌株與文獻(xiàn)[15]中涉及的為同一菌株，且培育方法一致。

2 方法與結(jié)果

2.1 混合對照品溶液的制備

分別稱取毛蕊異黃酮苷、芒柄花苷、毛蕊異黃酮、芒柄花素、黃芪皂苷Ⅳ、異黃芪皂苷Ⅱ、環(huán)黃芪醇、異黃芪皂苷Ⅰ對照品各適量，置于同一10 mL量瓶中，加甲醇制成各成分質(zhì)量濃度分別為0.320、0.120、0.100、0.128、1.000、0.400、0.800、0.800 mg/mL的混合對照品溶液，于4 ℃冷藏，備用。

2.2 九州蟲草-黃芪雙向固體發(fā)酵物的制備

按文獻(xiàn)方法[13]進(jìn)行九州蟲草菌種固體斜面培養(yǎng)和九州蟲草液體菌種培養(yǎng)。在此基礎(chǔ)上進(jìn)行黃芪雙向固體發(fā)酵：稱取黃芪藥材4 g、大米16 g，置于500 mL罐頭瓶中，加入35 mL營養(yǎng)液（以每克大米的質(zhì)量為標(biāo)準(zhǔn)，葡萄糖含量為0.5%，蛋白胨含量為1%，磷酸二氫鉀含量為1%，硫酸鎂含量為0.075%，維生素B1含量為0.1%，玉米面含量為1%，酵母膏含量為0.7%），覆以封口膜;在121 ℃下高壓滅菌20 min后，冷卻，每瓶接種5 mL九州蟲草液體菌種，快速均勻噴撒在固體培養(yǎng)基表面，以上操作均在無菌條件下進(jìn)行;在23 ℃避光培養(yǎng)7 d，然后轉(zhuǎn)為光照培養(yǎng)13 d，濕度均為60%，即得九州蟲草-黃芪雙向固體發(fā)酵物（以下簡稱“發(fā)酵黃芪”）。同時(shí)，以不加黃芪的發(fā)酵物作為空白樣品，同法分別平行發(fā)酵3份。將發(fā)酵黃芪、空白樣品在陰涼處風(fēng)干，粉碎后過40目篩，置于-20 ℃冰箱中保存，備用。另外，以黃芪藥材作為未發(fā)酵樣品對照，粉碎后過40目篩，置于干燥器中保存，備用。

2.3 供試品溶液的制備

稱取黃芪藥材4 g以及“2.2”項(xiàng)下發(fā)酵黃芪和空白樣品各10 g（均相當(dāng)于黃芪藥材4 g），精密稱定，分別置于250 mL圓底燒瓶中，加20倍量甲醇（mL/g）回流提取2次;每次提取2.0 h，分別合并提取液，減壓濃縮，然后轉(zhuǎn)移至10 mL量瓶中，用甲醇定容，即得黃芪供試品溶液、發(fā)酵黃芪供試品溶液和空白樣品供試品溶液。

2.4 色譜條件

色譜柱：Agilent 5 TC-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）;柱溫：30 ℃;流動相：乙腈（A）-0.1%甲酸水溶液（B），梯度洗脫（0～10 min，18%A;10～32 min，18%A→35%A;32～40 min，35%A;40～57 min，35%A→53%A;57～67 min，53%A→68%A）;流速：1.0 mL/min;進(jìn)樣量：15 ?μL;后運(yùn)行：10 min。檢測方式：HPLC-DAD-ELSD串聯(lián)檢測;DAD檢測波長：260 nm;ELSD參數(shù)：增益值為4，漂移管溫度為100 ℃，霧化器溫度為80 ℃，載氣流速為1.6 L/min。

2.5 方法學(xué)考察

2.5.1 專屬性考察 取“2.1”項(xiàng)下混合對照品溶液及“2.3”項(xiàng)下黃芪供試品溶液、發(fā)酵黃芪供試品溶液和空白樣品供試品溶液，分別按“2.4”項(xiàng)下色譜條件分析測定，記錄色譜圖。結(jié)果，各待測成分色譜峰與相鄰峰間的分離度良好，分離度均大于1.5，理論板數(shù)按毛蕊異黃酮苷峰計(jì)不低于7 000，且空白樣品對待測成分的測定無干擾。色譜圖見圖1。

2.5.2 線性關(guān)系、檢測限和定量限考察 精密吸取“2.1”項(xiàng)下混合對照品溶液適量，分別用甲醇溶劑稀釋成系列不同質(zhì)量濃度的對照品溶液，每種化合物至少配制6個(gè)適當(dāng)質(zhì)量濃度的系列對照品溶液。各成分的線性關(guān)系考察的質(zhì)量濃度具體設(shè)置如下：毛蕊異黃酮苷為0.32、0.16、0.08、0.04、0.02、0.01、0.005、0.002 5、0.001 25 ?mg/mL;芒柄花苷為0.12、0.06、0.03、0.015、0.007 5、0.003 75、0.001 88、0.000 94 mg/mL;毛蕊異黃酮為0.1、0.05、0.025、0.012 5、0.006 25、0.003 13、0.001 56 mg/mL;芒柄花素為0.128、0.064、0.032、0.001 6、0.008、0.004、0.002、0.001 mg/mL;黃芪皂苷Ⅳ為1、0.5、0.25、0.125、0.062 5、0.031 25 mg/mL;異黃芪皂苷Ⅱ?yàn)?.4、0.2、0.1、0.05、0.025、0.012 5 mg/mL;環(huán)黃芪醇為0.8、0.4、0.2、0.1、0.05、0.025 mg/mL;異黃芪皂苷Ⅰ為0.8、0.4、0.2、0.1、0.05、0.025 mg/mL。各系列對照品溶液按“2.4”項(xiàng)下色譜條件分析測定，記錄色譜圖。其中，毛蕊異黃酮苷、芒柄花苷、毛蕊異黃酮、芒柄花素以峰面積為縱坐標(biāo)（y）、質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（x，mg/mL）進(jìn)行線性回歸，計(jì)算回歸方程;黃芪甲苷、異黃芪皂苷Ⅱ、環(huán)黃芪醇、異黃芪皂苷Ⅰ以峰面積的對數(shù)值為縱坐標(biāo)（lgy）、質(zhì)量濃度的對數(shù)值為橫坐標(biāo)（lgx，mg/mL）進(jìn)行線性回歸，計(jì)算回歸方程。另取“2.1”項(xiàng)下混合對照品溶液適量，以甲醇溶劑逐級稀釋后按“2.4”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，以信噪比3 ∶ 1、10 ∶ 1分別計(jì)算檢測限和定量限。結(jié)果顯示，各待測成分在其各自進(jìn)樣質(zhì)量濃度范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系（R2均大于0.999 0），檢測限和定量限均滿足測定要求，結(jié)果見表1。

2.5.3 精密度試驗(yàn) 取“2.1”項(xiàng)下的混合對照品溶液適量，按“2.4”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，連續(xù)測定6次，記錄色譜圖并計(jì)算峰面積的RSD值，以考察日內(nèi)精密度。每天測定2次，連續(xù)測定3 d，記錄色譜圖并計(jì)算峰面積的RSD值，以考察日間精密度。結(jié)果顯示，毛蕊異黃酮苷、芒柄花苷、毛蕊異黃酮、芒柄花素、黃芪皂苷Ⅳ、異黃芪皂苷Ⅱ、環(huán)黃芪醇、異黃芪皂苷Ⅰ的日內(nèi)精密度RSD分別為0.72%、0.23%、0.78%、0.65%、0.88%、1.15%、0.66%、1.15%（n=6），日間精密度的RSD分別為1.02%、0.36%、0.98%、0.94%、1.04%、1.45%、1.09%、1.54%（n=3），表明儀器精密度良好。

2.5.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取“2.3”項(xiàng)下黃芪供試品溶液，分別于制備后室溫放置0、2、4、8、12、24 h時(shí)，按“2.4”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄色譜圖。結(jié)果顯示，毛蕊異黃酮苷、芒柄花苷、毛蕊異黃酮、芒柄花素、黃芪皂苷Ⅳ、異黃芪皂苷Ⅱ、環(huán)黃芪醇、異黃芪皂苷Ⅰ峰面積的RSD分別為1.41%、1.38%、0.79%、1.29%、1.35%、1.12%、1.02%、1.60%（n=6），表明供試品溶液在室溫放置24 h內(nèi)具有良好的穩(wěn)定性。

2.5.5 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批次黃芪樣品適量，共6份，精密稱定，按“2.3”項(xiàng)下方法分別制備6份黃芪供試品溶液，然后按“2.4”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄色譜圖，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程計(jì)算各成分含量。結(jié)果顯示，毛蕊異黃酮苷、芒柄花苷、毛蕊異黃酮、芒柄花素、黃芪皂苷Ⅳ、異黃芪皂苷Ⅱ、環(huán)黃芪醇、異黃芪皂苷Ⅰ的平均含量分別為0.368 9、0.166 5、0.198 1、0.144 1、0.121 9、0.113 3、0.908 6、0.047 78 mg/g，RSD分別為1.69%、0.94%、1.82%、1.48%、1.05%、1.20%、1.47%、1.38%（n=6），表明本方法重復(fù)性良好。

2.5.6 加樣回收率測定 取已知含量的黃芪樣品2.00 g，共6份，精密稱定，分別定量加入毛蕊異黃酮苷、芒柄花苷、毛蕊異黃酮、芒柄花素、黃芪皂苷Ⅳ、異黃芪皂苷Ⅱ、環(huán)黃芪醇、異黃芪皂苷Ⅰ對照品各適量，再按“2.3”項(xiàng)下方法制成供試品溶液，然后按“2.4”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄色譜圖，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程計(jì)算各成分的加樣回收率。結(jié)果顯示，毛蕊異黃酮苷、芒柄花苷、毛蕊異黃酮、芒柄花素、黃芪皂苷Ⅳ、異黃芪皂苷Ⅱ、環(huán)黃芪醇、異黃芪皂苷Ⅰ的平均加樣回收率分別為101.32%、98.66%、99.28%、100.04%、100.21%、100.37%、99.71%、97.88%，RSD分別為1.71%、2.39%、1.37%、1.63%、1.22%、1.95%、2.01%、1.74%（n=6），表明本方法準(zhǔn)確度較好，詳見表2。

2.6 樣品含量測定

取黃芪和發(fā)酵黃芪各適量，按“2.3”項(xiàng)下方法分別制備供試品溶液，然后分別按“2.4”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄色譜圖，并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程計(jì)算各待測成分含量。平行3份操作。采用SPSS 22.0軟件對兩組樣品進(jìn)行獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，P<0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。以未發(fā)酵黃芪中各成分含量為100%計(jì)，計(jì)算發(fā)酵黃芪中各成分的變化率[變化率（%）=（發(fā)酵黃芪中平均含量-未發(fā)酵黃芪中平均含量）/未發(fā)酵黃芪中平均含量×100%]。結(jié)果顯示，發(fā)酵后黃芪中8種成分的含量較發(fā)酵前均發(fā)生了顯著變化（P<0.05），其中黃芪皂苷Ⅳ、黃芪皂苷Ⅳ、異黃芪皂苷Ⅰ的含量均顯著增加，其余5種成分含量均顯著減少，結(jié)果見表3。

3 討論

3.1 檢測成分的選擇

黃酮類化合物和皂苷類化合物是黃芪的主要活性成分。現(xiàn)代藥理研究表明，黃芪中黃酮類化合物和皂苷類化合物在抗病毒、抗氧化、神經(jīng)保護(hù)、抗腫瘤、抗炎等方面具有廣泛的藥理活性[16-17]。其中，毛蕊異黃酮苷、毛蕊異黃酮具有抗氧化、抗病毒等藥理作用[18-19];芒柄花苷、芒柄花素具有體外抗乳腺癌的藥理作用[20-21];黃芪皂苷Ⅳ具有抑制非小細(xì)胞肺癌（A549細(xì)胞）的生長和增殖[22]、抗心力衰竭[23]、抗衰老[24]、保護(hù)心肌細(xì)胞[25]等多種作用;異黃芪皂苷Ⅱ具有抗炎[26]作用;環(huán)黃芪醇具有激活端粒酶的活性、抗衰老[27]等作用;異黃芪皂苷Ⅰ具有抗炎[28]、改善胰島素抵抗和治療糖尿病[29]的作用。因此，本研究選擇毛蕊異黃酮苷、芒柄花苷、毛蕊異黃酮、芒柄花素4種黃酮類成分及黃芪皂苷Ⅳ、異黃芪皂苷Ⅱ、環(huán)黃芪醇、異黃芪皂苷Ⅰ 4種皂苷類成分同時(shí)作為指標(biāo)性成分來探究雙向固體發(fā)酵對黃芪有效活性成分的影響。

3.2 色譜條件的優(yōu)化

因皂苷類化合物沒有共軛雙鍵，用紫外檢測器檢測的靈敏度較低，故DAD不適合用于黃芪中皂苷類化合物的檢測。與DAD檢測器的原理不同，ELSD檢測器是質(zhì)量型檢測器，具有通用性好、響應(yīng)信號不受其官能團(tuán)影響的特性，適合用于檢測皂苷類等沒有紫外吸收的化合物，但其具有靈敏度低、檢測下限高的缺點(diǎn)[30]。因此，本研究選擇DAD來檢測樣品中的黃酮類化合物，ELSD檢測器來檢測皂苷類化合物。在前期研究中，筆者比較了不同流動相系統(tǒng)（甲醇-水、甲醇-0.1%甲酸水溶液、乙腈-水、乙腈-0.1%甲酸水溶液等）的分離效果，發(fā)現(xiàn)0.1%甲酸水溶液可明顯改善色譜峰峰形，而乙腈-0.1%甲酸水溶液明顯比甲醇-0.1%甲酸水溶液分離度更好，因此本研究最終選擇乙腈-0.1%甲酸水溶液為流動相系統(tǒng)。此外，通過優(yōu)化霧化器和蒸發(fā)管的溫度、干燥氣流速等，提高了皂苷類化合物的檢測靈敏度，最終建立了HPLC-DAD-ELSD法同時(shí)測定黃芪發(fā)酵前后8種成分的定量方法。與王亞麗等[31]建立的類似成分含量測定方法相比，本方法在縮短了檢測時(shí)間的同時(shí)還獲得了較好的分離度，節(jié)約了分析的時(shí)間成本，為多指標(biāo)控制發(fā)酵黃芪的質(zhì)量提供了方法基礎(chǔ)。

3.3 九州蟲草雙向固體發(fā)酵對黃芪中8種成分含量的影響

本研究測定了黃芪經(jīng)九州蟲草雙向固體發(fā)酵前后8種成分的含量變化，其中發(fā)酵黃芪中黃芪皂苷Ⅳ的含量與2015版《中國藥典》（一部）（后文簡稱“藥典”）中黃芪項(xiàng)下黃芪皂苷Ⅳ含量標(biāo)準(zhǔn)（≥0.040%）[1]相比偏低。筆者分析原因可能是本研究的提取方法與藥典的提取方法不同所致，由于藥典方法中氨水洗滌會造成其他皂苷類成分向黃芪皂苷Ⅳ的轉(zhuǎn)化，使黃芪皂苷Ⅳ含量偏高，如果應(yīng)用到本研究中將無法解釋黃芪皂苷Ⅳ含量增加的原因，故本研究選擇了較為通用的甲醇回流提取方法。結(jié)果顯示，本研究中黃芪皂苷Ⅳ的含量測定結(jié)果與文獻(xiàn)[32]的測定結(jié)果較一致。

本研究結(jié)果顯示，發(fā)酵黃芪中4種黃酮類化合物的含量較未發(fā)酵黃芪均顯著降低。文獻(xiàn)研究表明，黃芪經(jīng)解淀粉芽孢桿菌液體發(fā)酵后毛蕊異黃酮、芒柄花素的含量顯著降低[33]，這與本研究結(jié)果相似——4種皂苷類成分除環(huán)黃芪醇外，其他3種成分的含量均顯著增加。侯美如等[34]研究發(fā)現(xiàn)，黃芪經(jīng)解淀粉芽孢桿菌固體發(fā)酵后，黃芪皂苷Ⅳ的含量僅增加了37.95%。但本研究中，發(fā)酵后黃芪的主要活性成分黃芪皂苷Ⅳ增加了289.20%。本課題組前期已證實(shí)經(jīng)九州蟲草雙向固體發(fā)酵后的黃芪發(fā)酵物對A549細(xì)胞生長、增殖的能力顯著增強(qiáng)，因此筆者推測黃芪皂苷Ⅳ含量的增加可能是發(fā)酵黃芪對A549細(xì)胞的抑制作用增強(qiáng)的原因之一。

環(huán)黃芪醇是黃芪皂苷Ⅳ合成的前體化合物[35]。本研究中，黃芪在發(fā)酵后其環(huán)黃芪醇的含量顯著下降，而黃芪皂苷Ⅳ的含量顯著增加，因此筆者推測環(huán)黃芪醇有可能在發(fā)酵過程中轉(zhuǎn)化成了黃芪皂苷Ⅳ。本研究結(jié)果表明，發(fā)酵前后黃芪中總皂苷含量幾乎一致，但存在皂苷類化合物之間相互轉(zhuǎn)化，如黃芪皂苷Ⅳ、異黃芪皂苷Ⅰ、異黃芪皂苷Ⅱ的含量顯著增加，其中異黃芪皂苷Ⅱ增加了20.25%、異黃芪皂苷Ⅰ增加了562.46%。結(jié)合各成分的藥理活性，筆者推測發(fā)酵黃芪的抗腫瘤、抗衰老、抗炎等作用也會顯著增加，故可以采用九州蟲草-黃芪雙向固體發(fā)酵技術(shù)改變黃芪中活性成分的含量，生產(chǎn)出具有抗腫瘤、抗衰老等生物活性的產(chǎn)品。

綜上所述，本研究建立了同時(shí)測定黃芪經(jīng)九州蟲草雙向固體發(fā)酵前后8種成分含量測定的HPLC-DAD- ELSD法。結(jié)果表明，經(jīng)九州蟲草發(fā)酵后，黃芪中黃酮類成分毛蕊異黃酮苷、芒柄花苷、毛蕊異黃酮、芒柄花素的含量均顯著下降;皂苷類成分除環(huán)黃芪醇含量顯著下降（降幅75.05%）外，黃芪皂苷Ⅳ、異黃芪皂苷Ⅱ、異黃芪皂苷含量均顯著增加。九州蟲草雙向固體發(fā)酵可顯著改變黃芪中有效成分含量，但在此過程中具體產(chǎn)生了何種新物質(zhì)及其發(fā)生的機(jī)制還有待于進(jìn)一步研究。

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