豬細小病毒分子生物學檢測方法的研究進展

余同江 陳 堅

（廣東永順生物制藥股份有限公司，廣東廣州 511356）

豬細小病毒病是由豬細小病毒（Porcine parvovirus，PPV）引起豬的繁殖障礙疾病，主要引起母豬發生流產、產死胎、木乃伊胎、畸形胎及弱仔等，亦可引起仔豬皮炎、腹瀉及呼吸系統疾病，在斷奶仔豬多系統衰竭綜合征中也起重要作用[1]。該病廣泛分布于世界各地，并在大多數豬場呈地方性流行，嚴重影響養豬業的發展。隨著分子生物學技術的不斷發展，常規PCR、實時熒光定量PCR、核酸探針、LAMP、RPA和基因芯片等檢測方法都已應用到豬細小病毒的檢測中，但在實際臨床應用中，由于各地的實驗條件存在差異，因此有必要挑選適合的方法進行檢測。

1 常規PCR方法

常規PCR（聚合酶鏈反應）是一種DNA體外擴增技術，通過瓊脂糖凝膠電泳分析擴增產物以實現快速診斷，是目前臨床應用較廣泛的檢測方法。鄒敏等[2]參考VP2基因建立了PPV的PCR檢測方法，符合性結果顯示：該PCR方法優于HA、VI以及IHA。使用該方法對215份病料進行了檢測，檢出陽性樣品25份，檢出率為 11.63%。Li等[3]通過序列分析、引物設計和參數優化，建立了CSFV、JEV、PRRSV、PCV2、PRV和PPV的多重PCR檢測方法，最低可檢測濃度為10-3ng/μl，具有很高的特異性，臨床檢測結果與單次PCR結果一致。

2 實時熒光定量PCR方法

熒光定量 PCR 方法可分為熒光染料和熒光探針，具有操作簡便、敏感性高、快速高效等優點，完全閉管操作污染小，可實時監測分析數據，結果更為準確、直觀。陳堅等[4]建立了PPV的SYBR GreenⅠ實時定量PCR檢測方法。結果表明，該方法具有良好的特異性，檢測PRRSV、CSFV、PRV、PCV2和SIV均為陰性；其最低檢出量為7 copies/μl，且批內和批間重復性良好。用該方法與常規PCR、LAMP方法對臨床病料進行檢測對比，顯示該方法靈敏度高、成本低。Song等[5]建立了一種基于TaqMan探針的PPV實時定量PCR檢測方法，其檢出限為1×102copies/μl，與PCV2、PRRSV、PRV、CSFV和JEV無交叉反應。該方法具有特異性和重現性。在41例臨床標本中，用該方法檢測到32例PPV，而用常規PCR方法檢測到11例PPV。

3 核酸探針方法

核酸探針方法是利用堿基互補原理檢測目的核酸片段，具有敏感性高、特異性強的特點，不僅是研究核酸結構和功能的重要手段，還可進行傳染病的早期診斷。Krell P J等[6]率先用32P標記的探針檢測細胞培養物中的PPV，最低可檢出 0.1pg 的DNA，其敏感度是HA的100倍。白紅光等[7]利用地高辛標記制備了兩種PPV核酸探針檢測方法，特異性試驗結果表明，這兩種探針都能與PPV DNA發生特異的陽性雜交，而與對照的PRV、PCV、PRRSV和HCV的核酸雜交呈陰性。敏感性試驗結果表明，克隆NS1探針敏感度為0.5 pg /μl，NS1基因PCR產物探針敏感度為1 pg/μl。

4 LAMP方法

LAMP（環介導等溫擴增）方法是日本學者NOTOMI等發明的一種體外等溫擴增特異核酸片段的技術。在等溫條件下，基因的擴增和產物的檢測可一步完成，擴增效率和特異性高，該方法用時短，對設備要求低。ZHAO等[8]建立了可視化環介導等溫擴增（LAMP）檢測PPV感染的方法。擴增產物用SYBR GreenⅠ染料染色后目測和常規瓊脂糖凝膠電泳分析，兩種方法的靈敏度相同。LAMP法檢測PPV的檢出限為10 copies，比常規PCR方法低100倍。該檢測方法與其他病毒不發生交叉反應，對1100個現場樣本進行檢測，檢測到660個陽性。胡瑞麗[9]建立了檢測PPV的LAMP方法并研制了試劑盒，用該檢測試劑盒對臨床樣品進行PPV的檢測限為10 copies/μl，而常規PCR檢測法的檢測限為1000 copies/μl，該方法不會與PCV2、PRRSV、PRV和CSFV發生交叉反應。用該檢測試劑盒對1100個臨床樣品進行檢測，320個樣品為陽性。

5 重組酶聚合酶（RPA）方法

重組酶聚合酶（RPA）方法是由PIEPENBURG等研發的一種由多種酶和蛋白的參與下，在恒溫條件下實現核酸指數擴增的技術，具有靈敏度高、特異性強、反應快速等特點。該方法可通過與試紙條、探針或凝膠電泳等相結合的方式，實現擴增產物的定量分析或可視化判別。劉立兵等[10]建立了38℃恒溫水浴鍋檢測PPV的RPA方法，在恒溫反應30min，能夠特異性的檢測PPV；以重組質粒pPPV-VP2作為模板，RPA的檢測限為102拷貝，同研究中應用的實時熒光定量PCR方法檢測限一致，比普通PCR方法高100倍；該方法對疑似PPV感染臨床樣品的陽性檢出率為82.6%，略低于實時熒光定量PCR（86.9%），明顯高于普通PCR（66.7%）。WANG等[11]建立了檢測PPV的實時RPA方法，在39℃下反應20 min，與其它病原無交叉，最低可檢測103拷貝的重組質粒。用該方法與實時PCR方法平行檢測115份樣品，兩種檢測方法的符合率為100%。

6 基因芯片方法

基因芯片又稱DNA芯片（DNA chip）或DNA微陣列，是將cDNA或寡核苷酸按微陣列方式固定在微型載體上制成。將分子生物學技術、計算機技術以及標記融于一體，可對DNA樣品的序列信息進行高效的解讀和分析，具有快速、高特異性、高靈敏性、高通量、多樣性等特點。吳鳳筍等[12]以VP2基因為目的基因設計引物和探針建立了PPV的基因芯片檢測方法，根據熒光信號的強度來確定是否存在PPV，檢測靈敏度可達34.5 ng/μl；同時用制備的基因芯片對臨床20份疑似PPV感染的病料進行檢測，檢測結果與PCR檢測結果符合率達100%。劉勝利[13]基于PCV2、PRRSV、PPV、JEV和CSFV的保守區域設計引物與探針，將探針噴點固化于醛基化基片上并進行后期處理，制備出寡核苷酸芯片。同時確立了最佳雜交反應條件為55℃雜交箱雜交2h，且探針濃度在1μM時即可得到較好的雜交信號。敏感性試驗結果表明該診斷方法達到了10-5ng級，臨床試驗結果與多重PCR檢測結果符合率達100%。

7 結語

在非洲豬瘟新常態下，更加需要嚴格做好豬場PPV的檢測和防控。雖然目前多種分子生物學檢測方法已應用于PPV的臨床檢測，但不同的檢測方法也存在一定的局限性，有時需將幾種檢測方法結合起來，綜合判斷，才能得到準確的檢測結果。相信隨著科學技術水平的不斷發展，更快速、準確、簡便的方法會在臨床檢測中發揮更重要的作用。