牛、羊包蟲病及其實(shí)驗(yàn)室診斷技術(shù)

烏云花

（新疆博爾塔拉蒙古自治州博樂市畜牧獸醫(yī)站，新疆博樂 833400）

1 牛、羊包蟲病分析

包蟲病是由棘球?qū)傧x種的幼蟲所致的疾病。目前被公認(rèn)的蟲種有細(xì)粒棘球穎蟲、多房棘球絳蟲、少節(jié)棘球絳蟲、伏氏棘球絳蟲。其形態(tài)、宿主和分布地區(qū)的不同，以細(xì)粒棘球絳蟲最為常見。本病的主要傳染源為狗、狼、狐、豺等。在包蟲病疫區(qū)的牛、羊群中常有包蟲病存在，而居民常以羊、牛等家畜內(nèi)臟不經(jīng)處理喂狗，使狗有吞食包蟲囊的機(jī)會(huì)，造成感染。腸內(nèi)感染蟲數(shù)有時(shí)可達(dá)數(shù)百至數(shù)千，其妊娠節(jié)片具有活動(dòng)能力，可污染在皮毛上，并引起肛門發(fā)癢。當(dāng)狗舐咬時(shí)把節(jié)片壓碎，糞便中蟲卵常污染狗的全身皮毛，如與其密切接觸，則很容易造成感染。人直接感染主要由于與狗親密接觸，若狗糞中蟲卵污染蔬菜或水源，尤其人畜共飲同一水源，可造成間接感染。羊、牛、人感染主要與環(huán)境衛(wèi)生及不良衛(wèi)生習(xí)慣有關(guān)。

2 實(shí)驗(yàn)室診斷技術(shù)

2.1 試驗(yàn)材料

2.1.1 檢測(cè)樣品來源

某縣某鎮(zhèn)家養(yǎng)牛、羊新鮮糞便共180份（每個(gè)鄉(xiāng)鎮(zhèn)采集40份）。

2.1.2 試驗(yàn)試劑

牛、羊糞包蟲抗原檢測(cè)試劑盒（生產(chǎn)廠家：深圳市康百得生物科技有限公司提供，批號(hào)：20180309）。

2.2 試驗(yàn)儀器

潔凈工作臺(tái)（生產(chǎn)廠家：青島海爾特種電器有限公司，型號(hào)：HR40-IIA2）、酶標(biāo)儀（生產(chǎn)廠家：北京拓普分析儀器有限公司，型號(hào)：ZS-3）、37oC恒溫箱（生產(chǎn)廠家：太倉(cāng)精宏儀器設(shè)備公司，型號(hào)：PSH-200）、可調(diào)單道移液器（生產(chǎn)廠家：北京青云航空儀表設(shè)備公司，型號(hào)：4500020）、多道微量移液器（生產(chǎn)廠家：北京青云航空儀表設(shè)備公司，型號(hào)：4610020）、電子天平（北京賽多利斯公司，型號(hào)：BS224S）、電子顯微鏡（生產(chǎn)廠家：重慶光電公司，型號(hào)：H-6000）、離C，J0L（生產(chǎn)廠家：湖南湘立科學(xué)儀器有限公司，型號(hào)：TG16-WS）、純凈水機(jī)（生產(chǎn)廠家：上海優(yōu)普實(shí)業(yè)有限公司，型號(hào)：uPT優(yōu)普）、超低溫保存箱（生產(chǎn)廠家：青島海爾特種電器有限公司，型號(hào)：DW-86L338）、外科剖檢儀器、鑷子、燒杯、燒瓶、試管、試管架、載玻片、膠頭滴管、食鹽、玻璃棒。

2.3 試驗(yàn)方法

2.3.1 檢測(cè)原理

本試劑盒采用夾心ELISA方法定性檢測(cè)牛、羊糞中包蟲抗原，如果待檢樣品中含有包蟲抗原，就會(huì)與包被板上的包蟲抗體及第二部加入的包蟲抗體酶標(biāo)結(jié)合物特異性結(jié)合，間接結(jié)合在包被板上的包蟲抗體酶標(biāo)結(jié)合物與底物反應(yīng)的顯色狀況即可反映出樣品中是否有包蟲抗原。

2.3.2 洗滌液配置

準(zhǔn)備500ml的錐形瓶2個(gè)，用蒸餾水將洗滌液10X（2號(hào)液）按l：10稀釋（例如，取100ml洗滌液10X加900ml蒸餾水混合），充分混合即為T作濃度洗滌液。

2.3.3 樣品稀釋液配置

用蒸餾水將樣品稀釋液2X（5號(hào)液）按1：1稀釋（如取100ml濃縮樣品稀釋液加100ml蒸餾水或去離子水），充分混勻即為T作濃度樣品稀釋液。

2.3.4 樣品處理

預(yù)先把采集來的牛、羊糞樣品放入超低溫冰柜（-7O℃以下）進(jìn)行冷凍7d以上，以滅活蟲卵。用電子天平稱取lg牛、羊糞放入10ml塑料試管中，試管中加入1ml樣品稀釋液，用玻璃棒充分?jǐn)嚢杈鶆颍o置l0min，取上清液于干凈塑料離心管中，再3000rpm離心10min，取上清液進(jìn)行編號(hào)記錄待檢。

2.3.5 加樣反應(yīng)

取試劑盒中的包被板進(jìn)行加樣，該包被板是96孔除去各對(duì)照孔，可做90份牛、羊糞樣品，將待檢上清液按順序放人血清管放置板上以便操作，在放置板上做好標(biāo)記以便判定結(jié)果。首先加陽(yáng)性對(duì)照2孔，每孔僅加入100μl陽(yáng)性對(duì)照品。空白對(duì)照2孔，每孔僅加入100μl樣品稀釋液；陰性對(duì)照2孔，每孔僅加入100μl陰性對(duì)照品；其余的樣品孔中，每孔僅加入100μl待檢樣品；蓋好封板膜，放入37℃恒溫箱避光反應(yīng)3Omin。

2.3.6 洗板

甩去孔內(nèi)液體，每孔注滿T作濃度洗滌液洗板6次，每次均需靜置1min；最后一次甩干凈，拍干。

2.3.7 加酶反應(yīng)

除空白對(duì)照孔外，其余每孔加酶結(jié)合物（1號(hào)液）100μl，蓋好封板膜，37℃：避光反應(yīng)30min，甩去孔內(nèi)液體，如上洗板，拍干。

2.3.8 顯色反應(yīng)

按所需用量，臨用前取等體積底物（3號(hào)液）和顯色劑（4號(hào)液）充分混勻后每孔加100μl，蓋好封板膜，37℃避光反應(yīng)l0min。

2.3.9 終止反應(yīng)

加終止液（6號(hào)液）50uL，以空白對(duì)照調(diào)零，用酶標(biāo)儀于450nm波長(zhǎng)（630nm作為參比波長(zhǎng)）讀取OD值。參考值（1）cut-of值（COV）=陰性對(duì)照孔OD值x2.1（陰性對(duì)照孔OD值<0.15時(shí)按0.15計(jì)）。（2）有效性判定：陰性對(duì)照孔OD值≤0.30（若大于0.30則試驗(yàn)無(wú)效）陽(yáng)性對(duì)照孔OD值≥0.50（若小于0，50則試驗(yàn)無(wú)效）檢驗(yàn)結(jié)果解釋：樣品OD值≥COV，判為包蟲抗原陽(yáng)性。樣品OD值

3 結(jié)語(yǔ)

包蟲病是一種人獸共患疾病，稱為動(dòng)物源性疾病，近年來流行病學(xué)調(diào)查表明為地方性寄生蟲病；在流行區(qū)帶有職業(yè)性損害的特點(diǎn)，被列為某些人群特別是畜牧從業(yè)人員的職業(yè)病，中間宿主包括家畜和野生動(dòng)物，預(yù)防包蟲病不僅是生物學(xué)范疇內(nèi)的一個(gè)問題，也是一個(gè)嚴(yán)重的社會(huì)問題，應(yīng)采取綜合措施。