兔皮膠原蛋白的性質及凝膠臨界模型的建立

張曉亮，張 毅

（天津工業大學紡織科學與工程學院，天津 300387）

膠原蛋白是天然細胞質基質的主要成分，是哺乳動物組織中最常見的蛋白質[1-3]，它可以作為一種生物醫用材料廣泛應用于組織工程、醫用創傷敷料、藥物緩釋等領域，同時在食品和化妝品行業也有著廣泛的應用[4-6]。兔皮中膠原蛋白含量高，而且在功能性質等方面優于水產類膠原蛋白，同時不存在豬皮、牛跟腱膠原蛋白在疫病等方面的限制，因此可以作為一種新的膠原原料[7-8]。

膠原蛋白凝膠是膠原蛋白分子在溶液中形成的具有三維網格結構的一種生物材料，它作為膠原蛋白一種重要的應用形式，在食品、藥物緩釋材料、膠原海綿和膠原膜的制備等方面有著廣泛應用[9-10]。國內外對于膠原蛋白凝膠的研究多集中在凝膠的功能性和應用性，而對于膠原蛋白形成凝膠條件的研究卻鮮有報道[11-12]。本實驗采用酸法從兔皮中提取膠原蛋白[13-15]，并對其理化性能進行分析，其次采用透析法制備膠原蛋白凝膠[16]，并且通過流變學分析pH值、溫度、濃度對兔皮膠原蛋白（rabbit skin collagen，RSC）溶液存儲模量（G’）和損耗模量（G”）的影響，進而探究這3 種條件對RSC形成凝膠的影響[17-18]。然后通過多組試驗獲得廣泛的數據，最后構建多元非線性數學模型，從理論上闡述pH值、溫度、質量濃度與G’和G”的數學關系，進而得到RSC溶液形成兔皮膠原蛋白凝膠（RSC-gel）的臨界條件，為膠原蛋白凝膠的形成及應用提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

肉兔皮 山東中梁農業發展有限責任公司；乙酸、NaOH、NaCl（均為分析純），KBr（光譜純） 天津風船試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

QSJ-C03A1打漿機 小熊電器股份有限公司；pH計 梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；TGL-16M離心機 湘儀（長沙）有限公司；SCIENTZ-10N真空冷凍干燥機 寧波新芝有限公司；MD 8000～14000透析袋 美國Sigma公司；CVO流變儀 英國Malvern公司；Evolution 201紫外-可見光分光光度計、Nicolet iS50型傅里葉變換紅外光譜儀 美國Themo Fisher公司；LA8080型氨基酸分析儀 日本Hitachi公司。

1.3 方法

1.3.1 RSC的提取

將冷凍的兔皮用去離子水洗凈后剪成1 cm2塊狀，然后置于0.1 mol/L的NaOH溶液中攪拌16 h，除去兔皮上的非膠原物質。將洗凈后的兔皮放入1 mol/L的乙酸溶液中，待兔皮溶脹后，用打漿機將兔皮打成漿狀，繼續加入上述乙酸溶液，使兔皮與乙酸溶液料液比為 1∶30（g/mL）。水解48 h后以10 000 r/min離心30 min，用5 mol/L的NaOH溶液將上清液的pH值調至中性，邊攪拌邊加入NaCl鹽析，使其最終濃度為5 mol/L。將鹽析出來的蛋白質以10 000 r/min離心30 min后復溶在1 mol/L的乙酸溶液中，然后以去離子水為透析液，將離心得到的蛋白質置于透析袋中，每6 h更換一次透析液，透析72 h后進行冷凍干燥，得到白色的兔皮膠原海綿。

1.3.2 RSC的提取率

根據GB/T 9695.23—2008《肉與肉制品 羥脯氨酸含量測定》[19]分別測定兔皮（濕）和RSC的羥脯氨酸含量，根據羥脯氨酸的含量計算RSC的提取率，如式（1） 所示：

1.3.3 氨基酸分析

采用氨基酸分析儀對RSC進行分析。

1.3.4 有機波譜分析

紫外-可見光光譜分析：將RSC溶解在1 mol/L的乙酸溶液中，以該乙酸溶液為空白在190～600 nm波長范圍內進行光譜掃描，步長1 nm，積分時間0.05 s。

傅里葉變換紅外光譜分析：在干燥條件下，將RSC粉末與KBr混合、壓片，光譜掃描范圍500～4 000 cm-1， 分辨率2 cm-1。

1.3.5 熱變性溫度的測定

配制質量分數為1%的RSC溶液，通過流變儀測定溶液在不同溫度下的黏度值，溫度范圍為10～50 ℃，升溫速率為5 ℃/min。

1.3.6 外部條件對RSC-gel形成的影響

1.3.6.1 溶液pH值對RSC-gel形成的影響

配制質量濃度為10 mg/mL的RSC溶液，置于透析袋中透析，在不同pH值時取樣，選用流變儀的振蕩模式測定溶液的G’與G”，測試夾具為20 mm平板，間隙為1 000 μm，振蕩頻率為0.2 Hz，振蕩應力為0.08 Pa，測試溫度為25 ℃。

1.3.6.2 溶液質量濃度對RSC-gel形成的影響

配制質量濃度為7、7.5、8、8.5、9 mg/mL的RSC溶液，置于透析袋中透析，在溶液pH 5時取樣，選用流變儀的振蕩模式測定溶液的G’與G”，流變儀其他參數設置同1.3.6.1節。

1.3.6.3 溫度對RSC-gel的形成的影響

配制質量濃度為8 mg/mL RSC溶液，置于透析袋中透析，在pH 5時取樣，采用連續升溫模式，選用流變儀的振蕩模式測定溶液的G’與G”，溫度測試范圍為15～40 ℃，升溫速率為2 ℃/min，流變儀其他參數設置同1.3.6.1節。

1.3.7 RSC-gel的凝膠臨界條件分析

分別配制質量濃度為6、8、10、12、20 mg/mL的RSC溶液，置于透析袋中透析，在不同pH值時，選用流變儀的振蕩模式分別測量不同溫度條件下RSC溶液的G’與G”，流變儀其他參數設置同1.3.6.1節。

1.4 數據處理

將所得實驗數據通過Matlab軟件對數據進行分析并建立回歸模型，使用SAS軟件對回歸模型進行檢驗。

2 結果與分析

2.1 RSC的提取率

羥脯氨酸是膠原蛋白特有的亞氨基酸，通過比色法測定提取前后羥脯氨酸含量的變化，可以準確描述膠原蛋白的提取率[20]。按照GB/T 9695.23—2008方法，以羥脯氨酸濃度為橫坐標、吸光度為縱坐標，繪制標準曲線方程為Y=0.01＋0.19X，R2=1。通過計算得RSC提取 率為69.18%。

2.2 氨基酸分析

表1 RSC氨基酸分析結果Table 1 Amino acid composition of RSC

從表1可以看出，RSC氨基酸總量為95.666%，含有7 種必需氨基酸與11 種非必需氨基酸，必需氨基酸質量分數為14.623%，非必需氨基酸質量分數為81.043%，其中羥脯氨酸質量分數為9.725%，可以作為一種補充氨基酸的食品源膠原蛋白。

2.3 有機波譜分析

2.3.1 紫外-可見光光譜分析

圖1 RSC的紫外-可見光光譜圖Fig. 1 UV spectrum of RSC

紫外吸收與肽鏈中的—COOH以及肽鍵中C＝O的n→π*躍遷有關[20]。從圖1可以看出，RSC的紫外最大吸收波長位于237 nm，與其他I型膠原蛋白類似，說明RSC為I型膠原蛋白[21]。而且RSC在283 nm和251 nm波長處均無明顯的紫外吸收，表明RSC含有很少的苯丙氨酸和酪氨酸，與氨基酸分析結果一致，同時RSC紫外吸收圖譜無其他的紫外吸收峰，表明提取得到的RSC純度高，不含有其他種類的蛋白質[22]。

2.3.2 傅里葉變換紅外光譜分析

圖2 RSC的紅外光譜圖Fig. 2 FTIR spectrum of RSC

由圖2可知，RSC的紅外光譜圖的特征峰有酰胺A、B和酰胺I、II、III帶。酰胺A（3 440 cm-1）是由N—H鍵的伸縮振動引起的，表明RSC之間具有較多的氫鍵[23]；酰胺B位于2 930 cm-1處，它是由C—H鍵的伸縮振動導致的。與其他膠原蛋白相比[24]，RSC酰胺I帶的吸收峰（1 640 cm-1）和酰胺II帶的吸收峰（1 550 cm-1）由高頻區轉入低頻區，表明RSC具有更高的結構秩序。酰胺III帶位于1 250 cm-1，1 450 cm-1處的峰面積與酰胺III帶的吸收峰面積比接近1∶1，說明RSC保持了完整的三螺旋結構[25]。

2.4 熱變性溫度分析

圖3 RSC溶液黏度隨溫度變化關系Fig. 3 Relationship of collagen solution viscosity with temperature

膠原蛋白的變性溫度可以通過測定其在不同溫度下的黏度值獲得，RSC溶液黏度值下降50%時的溫度即為RSC變性溫度[26]。由圖3可知，隨著溫度的升高，RSC溶液黏度值逐漸下降，其熱變性溫度為35.8℃，與中華鱉裙邊膠原蛋白的變性溫度相當（36.5 ℃），但高于鱈魚皮（20 ℃）膠原蛋白的變性溫度[27-28]。

2.5 外部條件對RSC-gel形成的影響

膠原蛋白分子在溶液中形成凝膠的實質是溶液中分子由無序狀態向有序空間結構的轉變，可以通過測定Maxwell力學模型中G’和G”描述這種變化過程[16]。G’描述的是材料存儲彈性變形能量的能力，是測定材料變形后回彈的指標，通常表征材料的類固體行為；G”是指材料在發生形變時，由于黏性形變而損耗的能量大小，反映材料黏性大小，通常表征材料的類液體行為。

當G’＜G”時，溶液呈液態，可近似看作是一種黏性液體；隨著G’增加，當G’=G”時，溶液呈半固態，凝膠開始形成；隨著G’持續上升，當G’＞G”時，溶液逐漸由半固態向類固態轉變。

2.5.1 pH值對RSC-gel形成的影響

圖4 RSC溶液pH值對凝膠的影響Fig. 4 Effect of pH on RSC gelation

從圖4可以看出，開始時，隨著pH值的升高，RSC溶液的G’和G”變化很小，且G’＜G”，這是由于溶液中的 H＋抑制了分子間氫鍵的形成，使得此時的RSC溶液具有液體的性質；而隨著透析的進行，溶液pH值逐漸增大，H＋濃度逐漸減小，氫鍵等分子間作用力逐漸增強，RSC分子間產生更多的糾纏和網格結構，溶液開始向凝膠態轉變，G’和G”均逐漸增大，且G’增大的速率高于G”，當G’≥G”時，溶液處于凝膠態。當G’=G”時，RSC溶液處于臨界凝膠態[29]。

2.5.2 RSC溶液質量濃度對RSC-gel形成的影響

圖5 RSC溶液質量濃度對凝膠的影響Fig. 5 Effect of collagen concentration on RSC gelation

從圖5可以看出，當溶液質量濃度較低時，兩種模量值很小，這是由于溶液中RSC分子的數目較少，此時 G’＜G”，溶液還處于液態；而隨著膠原蛋白質量濃度的增加，溶液中RSC分子數增加，G’和G”都逐漸增大，且G’的增長速率大于G”，當G’=G”時，溶液處于臨界 凝膠態[30]。

2.5.3 溫度對RSC-gel形成的影響

圖6 RSC溶液溫度對凝膠的影響Fig. 6 Effect of temperature on RSC gelation

從圖6可以看出，當體系溫度較低時，溶液的兩種模量較高，這是由于分子熱運動小，此時G’＞G”，體系處于凝膠態；而隨著溫度的升高，分子熱運動逐漸加劇，兩種模量均呈下降趨勢，且G’的下降速率大于G”，當G’=G”時，溶液處于臨界凝膠態；當G’＜G”時，分子熱運動加劇，溶液處于非凝膠態。

從圖4、5可以看出，RSC溶液的pH值和質量濃度與凝膠形成呈正相關，且兩種模量隨pH值和濃度的變化近似指數函數關系；而從圖6可看出，RSC溶液溫度與凝膠形成呈負相關，且在凝膠點附近，RSC溶液的兩種模量隨著溫度的升高而降低，近似于負相關的指數關系，因此可以通過構建一個數學模型描述pH值、質量濃度、溫度對RSC-gel模量的影響，以此確立凝膠的臨界條件。

2.6 RSC-gel臨界條件分析

2.6.1 數據處理與線性化轉變

將pH值、溫度、質量濃度3 個指標的數據作為自變量x，構建自變量矩陣：

將多組試驗所得的G’和G”分別作為因變量yG’和yG”，構建因變量矩陣：

綜合上述分析，構建pH值、溫度、質量濃度與模量（G’和G”）的數學模型：

式中：G為存儲模量G’或損耗模量G”；P為RSC溶液的pH值；C為RSC溶液的質量濃度；T為RSC溶液的溫度；k為系數。由上述模型可知，該數學模型為多元非線性數學模型，經線性化得：

2.6.2 多元線性回歸分析

2.6.2.1G’回歸分析

表2 G’方差分析 Table 2 Analysis of variance of G’ model

表3 G’回歸分析Table 3 Regression analysis of G’ model

表4 G’參數估計 Table 4 Parameter estimates of G’ model

由表2可知，其F值為207.23，P值小于0.000 1，認為y1與x1、x2、x3之間具有顯著的線性相關關系；由表3可知，R2值為0.945 3，說明該方程具有很高的擬合度。由表4可知，對于常數檢驗，t＝-10.20，P值小于0.000 1，說明截距項通過檢驗，估計值為-13.64；對于自變量x1、x2、x3，P值均小于0.000 1，說明所有自變量的系數均通過檢驗，表明該模型具有正確性，自變量系數分別為6.76、4.27 、-2.24。

綜合以上分析，可以得到線性回歸方程：

將上述線性回歸方程非線性化可得：

2.6.2.2G”回歸分析

表5 G”方差分析 Table 5 Analysis of variance of G” model

表6 G”回歸分析Table 6 Regression analysis of G” model

表7 G”參數估計Table 7 Parameter estimates of G” model

由表5可知，其F值為165.53，P值小于0.000 1，說明y2與x1、x2、x3之間具有顯著的線性相關關系；由表6可知，R2為0.932 4，說明該方程的擬合度很高；由表7可知，對常數檢驗，t＝-8.95，P值小于0.000 1，說明截距項通過檢驗，截距值為-10.22；對于自變量x1、x2、x3，P值均小于0.000 1，說明所有自變量的系數均通過檢驗，表明該模型具有正確性，自變量系數分別為4.74、3.36 、-1.59。

綜合以上分析，可以得到線性回歸方程：

將上述線性方程非線性化可得：

2.6.3 凝膠臨界模型的建立

從式（7）和式（9）可知，凝膠的兩種模量與體系的pH值、質量濃度呈正相關，與溫度呈負相關，與單因素試驗所得結論一致，且當G’=G”，即G’-G”=0時，膠原蛋白處于凝膠臨界狀態，聯立可得膠原蛋白的臨界凝膠條件方程：

式中：P為RSC溶液的pH值；C為RSC溶液的質量濃度；T為RSC溶液的溫度。當處于非凝膠態，時，RSC溶液時，溶液處于凝膠態。根據臨界方程用Matlab軟件作出的三維曲面如圖7所示，該曲面可直觀表示RSC溶液的pH值、質量濃度與溫度對凝膠形成的影響，曲面上所有的點都是凝膠的臨界點，曲面的內側為凝膠態，外側為非凝膠態。

圖7 凝膠臨界曲面Fig. 7 Critical surface of RSC gelation

3 結 論

采用酸法從肉兔皮中提取并得到了膠原蛋白，提取率達到69.18%。通過紫外光譜圖發現RSC的最大吸收波長為237 nm，屬于I型膠原蛋白，紅外光譜圖表明膠原蛋白保持了原有的三螺旋結構，同時測得其變性溫 度為35.8 ℃。

通過流變學對RSC凝膠條件進行研究后發現，RSC溶液pH值和質量濃度與RSC-gel形成呈正相關，而溶液溫度與RSC-gel形成呈負相關。

通過構建數學模型分析pH值、溫度、質量濃度對與RSC溶液形成凝膠的綜合影響，得到RSC溶液G’和數學關系，其凝膠臨界條件為。上述數學關系對于其他來源的膠原蛋白同樣適用，上述數學模型也可為其他材料凝膠的成形提供理論基礎。