高通量測序分析赤水曬醋各生產階段微生物群落結構變化

李榮源，盧紅梅，秦 興，陳 莉，汪 沙，吳 震

（貴州大學 貴州省發酵工程與生物制藥重點實驗室，釀酒與食品工程學院，貴州 貴陽 550025）

食醋作為常用的調味品和食品保藏劑，在中國具有悠久的發展歷史。早在2 500多年前就有食醋被用于調味和疾病治療的記載[1]。明朝時期，李時珍在《本草綱目》中就有記載：“醋能消腫、散火氣、殺邪毒、理諸藥之功效”[2]。現代醫學研究表明食醋具有降血壓、降血脂、抗疲勞、抗菌殺菌、調節血糖、抗氧化等功效[3-5]。

赤水曬醋是貴州省赤水市生產的一種具有典型地方特色的優質食醋產品，由多種中藥材制作成藥曲和大米、糯米、麩皮發酵生產而成。其生產過程主要分為4 個階段：采藥制曲階段、乙醇發酵階段、醋酸發酵階段和醋醅曝曬階段。赤水曬醋最顯著的特點便是“曬”，獨特的醋醅曝曬階段可以促進醋液中風味物質積累，其次是以藥制曲的工藝，在制曲過程中加入108 種[6]中草藥粉成分，使曬醋不但具有很高的食用價值，還兼有一定的藥用作用。曬醋中檢測出的2,4,5,6-四甲基吡嗪（川芎嗪，揮發性成分相對含量的6.00%）的含量較高，使得曬醋具有一定的保健功效[7]。曬醋醋曲的制作是在自然條件下進行的，包含了各種微生物的生長，由于中草藥本身具有抑菌、抗氧化等生物活性，既能保持赤水曬醋的獨特風味，防止產生異味，又可以促進霉菌等的生長，提高醋曲的品質，從而形成赤水曬醋獨具特色的風味特征。

現代生物技術的高速發展帶來了高通量測序[8-9]和變性梯度凝膠電泳（denatured gradient gel electrophoresis，DGGE）[10-12]等技術在食醋發酵中微生物群落測定的應用，以至于有越來越多對發酵食品的微生物組成、發酵過程中的變化以及功能的研究。Solieri等[13]研究意大利傳統香醋的酵母菌群落，發現大部分菌株屬于Zygosaccharomyces屬，其中，Z. bailii的豐度占41%。Ilabaca等[14]研究智利傳統食醋發酵過程中微生物變化，發現食醋在發酵末期僅存的醋酸菌為Acetobacterpasteurianus。Wu Jiajia等[15]研究食醋固態發酵過程中醋酸菌的多樣性，結果表明，醋酸菌主要是A. pasteurianus。本研究將通過高通量測序方法分析檢測各階段樣品及藥曲中細菌和真菌的種類和含量，結合微生物群落結構變化研究赤水曬醋發酵過程中物質含量變化的深層原因，對進一步了解赤水曬醋工藝和認識赤水曬醋具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

藥曲制備樣品：隨機選取3 個將用于生產的曲塊，取3 個樣品（YQ-1、YQ-2、YQ-3）進行分析。

乙醇發酵樣品：選取上述3 個曲塊所屬的乙醇發酵結束的發酵缸，取3 個樣品（JJFJ-1、JJFJ-2、JJFJ-3）進行分析。

醋酸發酵樣品：選取上述3 個發酵缸所屬的醋酸發酵結束的發酵槽，木槽四周和中間等量醋醅混勻，取3 個樣品（CSFJ-1、CSFJ-2、CSFJ-3）進行分析。

曝曬醋醅樣品：選取同屬一個醋酸發酵槽的3 個曝曬3 a的曝曬壇，曬壇上部、中部、下部各不同位置等量醋醅混勻，取3 個樣品（SCP-1、SCP-2、SCP-3）進行分析。

DNA抽提試劑盒 美國Omega BioTek公司；2%瓊脂糖凝膠 法國Biowest公司；FastPfuPolymerase 北京TransGen公司；AxyPrep DNA Gel Extraction Kit 美國Axygen公司；Fast DNA SPIN Kit for Soil 美國MP Biomedicals公司。

1.2 儀器與設備

N13462C移液器、5430 R小型離心機、5424R高速臺式冷凍離心機 德國Eppendorf公司；ABSON MiFly-6小型離心機 合肥艾本森科學儀器有限公司； NanoDrop2000超微量分光光度計 美國Thermo Fisher Scientific公司；DYY-6C電泳儀 北京市六一儀器廠；GeneAmp?9700型聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）儀 美國ABI公司；MiSeq測序儀、HiSeq測序儀 美國Illumina公司；ELx800酶標儀 美國BioTek公司；TBS380微型熒光計 美國Turner BioSystems公司；Covaris M220 Gene有限公司； QL-901旋渦混合器 海門其林貝爾儀器制造有限公司；TL-48R粉碎研磨儀 上海萬柏生物科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品預處理

參考文獻[16]方法。2 g醋醅樣品，20 mL磷酸鹽緩沖溶液（phosphate buffer saline，PBS）（137 mmol/L NaCl、2.7 mmol/L KCl、10 mmol/L Na2HPO4、2 mmol/L KH2PO4，pH 7.0）懸浮，加0.5 g玻璃珠，渦旋儀最大渦旋速度充分渦旋5 min。4 ℃、200×g離心5 min，收集上清液，將沉淀用PBS洗滌2 次并收集上清液。將所有上清液4 ℃、10 000×g離心10 min棄去上清液，收集沉淀。收集的沉淀用1 mL PBS重懸，轉入1.5 mL的EP管 中，-20 ℃凍存備用。

1.3.2 DNA提取

使用DNA抽提試劑盒提取醋醅或醋液內含物微生物DNA。所有樣品的DNA提取步驟均參照DNA抽提試劑盒說明書，并用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測提取質量。

1.3.3 PCR擴增及測序

按指定測序區域，合成帶有barcode的特異引物338F/806R、ITS1F/ITS2R（上海美吉生物公司），利用引物擴增出特異性序列，具體引物見表1。

表1 PCR引物Table 1 Sequences of primers used for PCR

細菌PCR體系：20 μL rTaqDNA聚合酶，2 μL 10×Buffer，2 μL 2.5 mmol/L dNTPs，引物各0.8 μL，0.2 μLTaq酶，0.2 μL牛血清蛋白，10 ng模板DNA，20 μL ddH2O；反應條件：95 ℃預變性3 min；95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，27 次循環；72 ℃延伸10 min。

真菌PCR體系：20 μLTransStart FastPfuDNA聚合酶，4 μL 5×FastPfuBuffer，2 μL 2.5 mmol/L dNTPs，引物各0.8 μL，FastPfu聚合酶0.4 μL，牛血清蛋白0.2 μL，模板DNA 10 ng，ddH2O 20 μL；反應條件：95 ℃預變性3 min；95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，27 次循環；72 ℃延伸10 min。

根據PCR擴增產物濃度進行等濃度混樣，使用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測效果。使用AxyPrepDNA凝膠回收試劑盒切膠回收PCR產物，純化后的樣品使用TruSeqTMDNA Sample Prep Kit建庫試劑盒進行文庫構建，構建測序文庫后在MiSeq平臺進行高通量測序。

1.4 數據處理

MiSeq測序得到雙端序列數據，根據PE reads之間的overlap關系，將成對reads拼接（merge）成一條序列，對reads的質量和merge的效果進行質控過濾，根據序列首尾兩端的barcode和引物序列區分樣品得到有效序列，并校正序列方向，得到優化數據。使用FLASH、Trimmomatic以以下標準進行數據優化：1）過濾reads尾部質量值20以下的堿基，設置50 bp的窗口，如果窗口內的平均質量值低于20，從窗口開始截去后端堿基，過濾質控后50 bp以下的reads，去除含N堿基的reads；2）根據PE reads之間的overlap關系，將成對reads拼接（merge）成一條序列，最小overlap長度為10 bp；3）拼接序列的overlap區允許的最大錯配比率為0.2，篩選不符合序列；4）根據序列首尾兩端的barcode和引物區分樣品，并調整序列方向，barcode允許的錯配數為0，最大引物錯配數為2。得到最終優化數據。

將最終優化數據在97%相似度水平下進行操作分類單元（operational taxonomic units，OTU）聚類分析，根據聚類分析結果：1）進行α多樣性分析，其中菌群豐度可由ACE指數進行評估，其數值越高表明群落物種豐富度越高；菌群多樣性由Shannon指數、Simpson指數進行評估，Shannon指數與群落多樣性呈正相關，Simpson指數呈負相關。覆蓋率是測序深度指標。2）分別繪制樣品各分類學水平下的群落結構圖、Venn圖、Heatmap熱圖、β分析圖、主坐標分析（principal co-ordinates analysis，PCoA）圖。

2 結果與分析

2.1 α多樣性分析

根據97%相似性水平下的OTU信息，采用α多樣性指標的ACE指數、Shannon指數及Simpson指數對樣品微生物物種豐富度和多樣性進行評估，結果見表2。所有樣品的OTU覆蓋率為99.93%～99.99%，表明樣品中的微生物種類幾乎都被檢測到。稀釋曲線主要利用各樣本測序量在不同測序深度時的微生物多樣性指數構建曲線，從而反映各樣本在不同測序數量時的微生物多樣性。當稀釋曲線趨向于平緩時表明測序數據量較為合理。基于97%相似度的OTU水平制作的細菌和真菌的稀釋曲線如圖1所示，曲線平緩，說明測序深度較好，測序數據量合理。

表2 α多樣性分析Table 2 Microbial α-diversity indices of samples

圖1 基于97%相似度OTU高通量測序的稀釋曲線Fig. 1 Rarefaction curves based on OTUs with 97% similarity obtained by Illumina MiSeq sequencing

2.2 微生物的組成分析

圖2 樣品中細菌在目水平上的物種相對豐度Fig. 2 Relative abundances of the major bacterial orders in samples

圖3 樣品中真菌在目水平上的物種相對豐度Fig. 3 Relative abundances of the major fungal orders in samples

由圖2、3 可得，在目水平上，各個階段的微生物結構差異明顯，乙醇和醋酸發酵階段的微生物結構有一定的延續性。藥曲階段，鏈霉菌亞目（Streptomycetales）、芽孢桿菌目（Bacillales）和乳酸桿菌目（Lactobacillales）是細菌優勢菌目，占細菌總量的80%～98%，散囊菌目（Eurotiales）（96.7%～99.3%）是真菌優勢菌目，且能看出各個樣品間的差異較大，說明每個曬壇內部都具有獨特的微生物結構。乙醇發酵階段，乳酸桿菌目（86.7%～97.3%）是細菌優勢菌目，有少量紅螺菌目（Rhodospirillales）、梭菌目（Clostridiales）和芽孢桿菌目，散囊菌目（89.3%～95.3%）是真菌優勢菌目，還有少量的絲孢酵母目（Trichosporonales）、酵母目（Saccharomycetales）（0.4%～8.7%）。醋酸發酵階段，乳酸桿菌目（60.4%～81.6%）和紅螺菌目（16.3%～32.4%）是細菌優勢菌目，有少量芽孢桿菌目（1.5%～6.5%），散囊菌目（65.5%～84.5%）是真菌優勢菌目，酵母目（5.6%～8.7%）的比例則在醋酸發酵階段上升。醋醅曝曬階段，紅螺菌目（6.8%～34.3%）、芽孢桿菌目（5.5%～67.6%）、棒桿菌目（Corynebacteriales）（4.6%～17.8%）、伯克霍爾德氏菌目（Burkholderiales）（2.0%～12.9%）、假單胞菌目（Pseudomonadales）（0.5%～9.1%）和乳酸桿菌目（0.8%～12.1%）等細菌均有發現，散囊菌目（2.7%～3 4.4%）、煤炱目（Capnodiales）（4.0%～28.3%）、格孢腔菌目（Pleosporales）（1.0%～33.9%）和酵母目（1.0%～6.2%）等真菌也被發現。

表3 各樣品在屬水平的優勢菌種Table 3 Dominant bacterial and fungal strains in samples at the genus level

表4 樣品在屬水平共有微生物種類數的統計Table 4 Number of bacterial and fungal species common to samples at the genus level

圖4 樣品中細菌在屬水平上的物種相對豐度Fig. 4 Relative abundances of the major bacterial genera in samples

圖5 樣品中真菌在屬水平上的物種相對豐度Fig. 5 Relative abundances of the major fungal genera in samples

由表3、4可知，18 種細菌和16 種真菌在每個階段都有發現，且在乙醇發酵、醋酸發酵和曝曬階段共有的真菌、細菌相對較多，在曝曬階段獨有的細菌種類數達到205 種，真菌種類數達到69 種，各個階段的共有真菌、細菌種類數也體現出了菌群的延續性。由圖4、5 可知，細菌的芽孢桿菌屬（Bacillus）、高溫放線菌屬（Thermoactinomyces）和真菌的曲霉屬（Aspergillus）、嗜熱真菌屬（Thermomyces）都有較大相對豐度，這些菌屬在藥曲的生長代謝中會產生各種發酵所需的酶和氨基酸，如芽孢桿菌屬能產蛋白酶、α-淀粉酶和L-酪氨酸等物質[17-18]，高溫放線菌屬能分泌具有耐高溫性質的α-淀粉酶、TVA I和TVAII[19-20]，曲霉屬可代謝產生大量高活性的蛋白酶及糖化酶[21-22]且部分菌種能轉化甾類、生物堿類和吩嗪類化合物等[23]，嗜熱真菌能夠生產β-1,4-內切木聚糖酶，該酶能以內切方式作用于木聚糖主鏈，產生不同鏈長的寡糖和少量的木糖[24]。這些菌種在發酵過程對分解淀粉、蛋白質等物質有重要作用。

藥曲階段，部分樣品中鏈霉菌屬（Streptomyces）有較大的相對豐度，能分泌抗生素類物質抑制其他菌種的生長，代謝生產抗腫瘤物質[25]，還有糖單孢菌屬（Saccharomonospora）、糖多孢菌屬（Saccharopolypora）、絲孢酵母菌屬（Trichosporon）等能分泌多種物質，如糖多孢菌屬能產生絲氨酸蛋白酶、纖維素降解促進因子等[26]，絲孢酵母菌屬能分泌β-葡萄糖苷酶，該酶屬于纖維素酶，能提高揮發性香氣成分的含量，可提升食醋的風味[27]。

乙醇發酵階段，曲霉屬、嗜熱真菌屬和絲孢酵母菌屬是真菌優勢屬，乳桿菌屬是乙醇發酵中唯一優勢細菌菌屬，分析原因是由于發酵缸除表層外都處于無氧環境，較適宜乳桿菌屬的生長，此外，醋酸單胞菌屬（Acetobacter）和葡糖醋桿菌屬（Gluconacetobacter）在乙醇發酵醪液中都被檢出。據報道，黃曲霉（Aspergillusflavus）等絲狀真菌可利用木糖生產乙醇[28]，Clostridium屬細菌能利用纖維素、半纖維素或五碳糖生產乙醇[29-30]，這些菌在樣品中的相對豐度達到1.0%～6.3%和0.3%～6.4%，且各個階段都有檢出。乙醇發酵階段是多邊發酵過程，醋酸菌和產膜酵母的代謝會消耗乙醇，且其他物質也會在該階段積累，如有機酸、氨基酸等，造成了發酵醪液中乙醇含量低，酸度高。乙醇含量呈先增后降，酸度呈持續上升的趨勢。乳桿菌屬是乙醇發酵中唯一優勢細菌菌屬，也使得曬醋制備中不揮發酸比例較高，保證赤水曬醋獨特的風味品質。

醋酸發酵階段，醋酸單胞菌屬的相對豐度明顯增加，達到16.1%～31.6%，葡糖醋桿菌屬也有增加，說明醋酸代謝較旺盛，由于乙醇發酵階段乳桿菌屬的大量存在，所以乳酸菌在醋酸發酵階段仍占細菌的主體。醋醅曝曬過程中，微生物的種類大大增加，如紅球菌屬（Rhodococcus）、枝孢屬（Cladosporium）、梗孢酵母屬（Sterigmatomyces）、枝頂孢屬（Acremonium）等，這些微生物促進了曝曬醋醅中各種物質的積累，提升赤水曬醋的品質，如紅球菌屬菌可以生產亮氨酸、苯丙氨酸和類胡蘿卜素[31-32]，枝孢屬可以產纖維素酶[33-34]，枝頂孢屬菌可以分泌酚類、萜類、環肽、蒽酮類等物質[35]，梗孢酵母屬能夠產生各種細胞色素且是豆醬的主要功能微生物[36-37]。

Heatmap用顏色變化反映二維矩陣或表格中的數據信息，它可以直觀地以顏色深淺定義數值的大小，常通過顏色的梯度及相似程度反映數據的相似性和差異性。由圖6a可得，在細菌屬水平，乙醇和醋酸發酵的聚類分析結果最為接近，表示這6 個樣品所含細菌種類及其豐度相似，主要是由于2 個階段的發酵環境具有延續性且相似。與之較接近的是醋醅曝曬階段，分析是因為細菌主要來源于醋酸發酵醋醅，在曝曬中因環境的改變而形成獨特的細菌結構，但仍有一定的連續性。藥曲中形成了獨特的細菌結構，這是不同的發酵環境所致。SCP-1與YQ-2被分為同一類，具體分析可以看出，SCP-1的細菌種類明顯高于YQ-2，其原因是二者的鏈霉菌屬、芽孢桿菌屬和高溫放線菌屬的豐度較為接近。由圖6b可得，樣品真菌屬與細菌屬水平的聚類分類結果相似。乙醇和醋酸發酵被分在一個大類，藥曲則因其優勢菌屬嗜熱真菌屬和曲霉屬的豐度等級與之相似，也被分為一個大類，同樣的也有SCP-2。嗜熱真菌屬豐度等級較高的JJFJ-1、JJFJ-2、 JJFJ-3和YQ-2、YQ-3分為一個小類，曲霉屬豐度等級較高的CSFJ-1、CSFJ-2、CSFJ-3和YQ-1被分為另一個小類。曝曬醋醅的真菌種類明顯比其他樣品豐富，因此，曝曬醋醅被獨立分為一類。

圖6 樣品物種相對豐度排名前30的屬及在每個樣品中的豐度聚類熱圖Fig. 6 Heat map analysis of top 30 most abundant genera in samples

2.3 β多樣性分析

圖7 樣品的層級聚類分析Fig. 7 Hierarchical clustering analysis of microbial community structure in samples using weighted UniFrac distance algorithm

β多樣性表示不同群落間物種組成變化，即“與環境梯度或環境格局相關的群落組成變化幅度或群落分化程度”[38]。本研究使用weighted UniFrac距離算法分析赤水曬醋發酵各階段的微生物多樣性。由圖7a可得，考慮到樣本間的細菌種類和豐度因素，乙醇和醋酸發酵階段各自為一個小類，然后聚為一個大類，表現出這2 個階段的延續性和與其他階段的不同。SCP-2、SCP-3和YQ-1、YQ-3同樣各自為一個小類，然后聚成一個大類。但SCP-1和YQ-2被分為了一類，這一分類結果同樣是由于二者的鏈霉菌屬、芽孢桿菌屬和高溫放線菌屬的豐度較為接近。但由β多樣性可以看出，曝曬醋醅和藥曲細菌多樣性存在相似，與乙醇和醋酸發酵樣品有明顯差異，推測是由于兩者相似的固態、高溫和低含氧量的發酵環境。圖7b中將乙醇發酵和藥曲樣品分為一類，然后與醋酸發酵和SCP-2分為一個大類，SCP-1和SCP-3則分為一類，說明藥曲和乙醇發酵的真菌多樣性相似，而SCP-2與SCP-1、SCP-3的相似性較低。

PCoA是一種非約束性的數據降維分析方法，使用PCoA圖可展示各樣品間微生物群落結構的差異。從 圖8a可得，PCoA1的貢獻率為64.59%，可知乙醇和醋酸發酵的細菌微生物結構相似，藥曲和曝曬醋醅的細菌微生物結構相似，但樣品之間差異性較大，尤其是YQ-2和SCP-1與其他同一階段樣品距離較遠。圖8b則顯示，藥曲、乙醇和醋酸發酵樣品的真菌微生物結構相似，與曝曬醋醅樣品有明顯區別，并且曝曬醋醅樣品之間也有較大差異。這符合聚類分析結果，但PCoA可清晰反映曝曬醋醅樣品之間微生物結構的較大差異，分析是因為醋醅分裝在曬場的曝曬壇內，無論是裝壇以前的微生物結構，還是曝曬環境都存在區別，導致曝曬醋醅樣品之間的微生物結構有明顯差異。

圖8 樣品中細菌和真菌群落的PCoAFig. 8 PCoA of bacterial and fungal communities present in samples

3 結 論

本研究采用高通量測序檢測赤水曬醋各生產階段微生物群落結構，結合豐度聚類熱圖和β多樣性分析表明。對于細菌，乙醇發酵和醋酸發酵相似度最高。對于真菌，藥曲制備、乙醇發酵和醋酸發酵的微生物結構相似度較高，醋醅曝曬階段的微生物結構則有明顯差異。發現從藥曲、乙醇發酵、醋酸發酵至醋醅曝曬都有微生物的傳承，但每個階段存在環境和條件的差異，使微生物結構不斷變化，尤其是在醋醅曝曬階段各個樣品之間的差異更為明顯。通過微生物結構分析，在乙醇發酵和醋酸發酵階段都是乳桿菌屬、醋桿菌屬和曲霉屬、嗜熱真菌屬、絲孢酵母屬占絕對優勢菌屬，起到了主導作用，這兩個階段是赤水曬醋中主要物質積累的過程，生產大量的有機酸、氨基酸等物質。在醋酸發酵和醋醅曝曬階段，酵母菌的活性并沒有受到抑制，共檢出了梗孢酵母屬、德巴利氏酵母屬（Debaryomyces）、紅酵母屬（Rhodotorula）和絲孢酵母菌屬等非釀酒酵母，并且在部分樣品中有較高的相對豐度，它們能夠產生包括萜類化合物、酯類、高級醇、丙三醇、乙醛、乙酸和琥珀酸的風味化合物，增加了赤水曬醋中風味成分的種類和含量。而醋醅曝曬階段微生物結構則不同于其他階段，無論是細菌還是真菌都沒有絕對優勢菌種存在，同時也是微生物種類最多的階段，有194 種真菌和400 種細菌被檢測到。因此，在這一重要階段會代謝生產大量營養物質，從而形成赤水曬醋獨具特色的風味品質。