華東覆盆子果、莖與葉的酚類成分及抗氧化活性分析

陳青青，李 柯，唐曉清,*，耿 麗，王 磊，彭雅萍

（1.南京農業大學園藝學院，江蘇 南京 210095；2.句容市茅山仙草中藥材專業合作社，江蘇 句容 212404）

華東覆盆子（Rubus chingii Hu）為薔薇科懸鉤子屬多年生灌木，主要分布于華東地區，其果實藥食兩用，具有補腎固精、養肝明目的功效[1]。目前果實藥用價值深入研究不足，保健與食用方面的研究開發過少，成為國內華東覆盆子產業化進程的制約因素[2-3]。華東覆盆子葉具有治療發燒、糖尿病、月經疼痛、腹瀉和絞痛的功效[4]。 在枝葉更替過程中，需要大量的修剪，合理利用修剪的廢棄枝葉有助于開發華東覆盆子的莖葉資源。

薔薇科懸鉤子屬的果實富含酚類化合物且具有抗氧化力，Vanessa等[5]研究發現巴西樹莓的總酚含量及1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-l-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基清除能力顯著高于櫻桃和藍莓，陸維克等[6]研究發現10 個樹莓品種都表現較高的氧化自由基吸收能力（oxygen radical absorbance capacity，ORAC），ORAC值范圍為172.71～205.17 μmol/g，具有抗氧化活性。華東覆盆子果實含鞣花酸、槲皮素及山柰酚-3-O-蕓香糖苷等化學成分，這些成分被證明具有顯著的清除自由基 能力[7-8]。吳峰華等[9]用不同溶劑提取華東覆盆子其果實，發現提取物的羥自由基清除能力（IC50=1.34 mg/mL） 高于2,6-二叔丁基對甲酚（2,6-d i-tert-buty l-4-methylphenol，BHT）（IC50=1.45 mg/mL）。研究發現，漿果類植物的葉片中酚類化合物含量明顯高于果實，且具有更高的抗氧化活性[10-11]。Zhang Tiantian等[12]研究得出華東覆盆子葉的多糖相對于果實有更強的清除自由基能力及更好的抗炎、抗腫瘤效果，顯示華東覆盆子葉具有潛在的利用價值。目前還鮮見報道華東覆盆子莖葉酚類成分的分析及抗氧化活性的比較。

因此，本研究測定華東覆盆子果、莖及葉的醇提物中總黃酮、總多酚和原花青素含量，并采用超高效液相色譜-串聯質譜（ultra-high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry，UPLC-MS/MS）聯用技術分析果、莖及葉的主要酚類物質成分，采用分光光度法測定各部位的DPPH自由基清除率、2,2’-聯氮雙(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)（2,2’-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)，ABTS）陽離子自由基清除率及鐵離子總還原能力（Ferric ion reducing antioxidant power，FRAP）以比較各部位的抗氧化活性，旨在為開發華東覆盆子不同部位成為抗氧化劑提供理論參考，促進其果、莖及葉的綜合利用。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

華東覆盆子莖、嫩葉和老葉于2019年5月15日采摘于句容市九板橋和樸園，105 ℃殺青5 min后，60 ℃干燥至恒質量；果為由綠變黃時采摘，置沸水中略燙取出曬干[1]， 經南京農業大學王康才教授鑒定為薔薇科懸鉤子屬華東覆盆子（Rubus chingii Hu）的果、莖及葉。

蘆丁、兒茶素、鞣花酸、沒食子酸、2,4,6-三吡啶基三嗪（2,4,6-tris(2-pyridy1)-1,3,5-triazine，TPTZ）、ABTS、水溶性VE（Trolox） 上海源葉生物科技有限公司；DPPH 美國Sigma公司；山柰酚-3-O-蕓香糖苷、椴樹苷 上海遠慕生物科技有限公司。

1.2 儀器與設備

DHG-QU70A型電熱恒溫鼓風干燥箱 上海精宏實驗設備有限公司；HK01-10BT超聲波清洗機 上海漢克科學儀器有限公司；5810R離心機 德國艾本德股份公司；G2-XS超高液相色譜-串聯質譜儀 美國Waters公司。

1.3 方法

1.3.1 華東覆盆子果、莖及葉的活性成分含量測定

1.3.1.1 樣品處理

樣品干燥后粉碎，過篩（100 目），取樣品0.5 g，加入10 mL體積分數70%的甲醇，45 ℃、360 W超聲提取30 min，反復提取2 次，合并濾液后置于4 ℃冰箱保存，此溶液即為提取液。

1.3.1.2 總酚含量測定

參照Kim等[13]的方法，以沒食子酸為標準品繪制標準曲線，得到曲線方程為：y=0.005 9x＋0.013（R2=0.996 2），結果以每克干物質中沒食子酸當量表示。

1.3.1.3 總黃酮含量的測定

參照Siddhuraju等[14]的方法，以蘆丁為標準品繪制標準曲線，得到曲線方程為：y=0.001 1x＋0.016（R2=0.998 3），結果以每克干物質中蘆丁當量表示。

1.3.1.4 總縮合單寧含量的測定

參照Nakamura等[15]的方法，以兒茶素為標準品繪制標準曲線，得到曲線方程為：y=2.541 7x＋0.009 5（R2=0.996 7），結果以每克干物質中兒茶素當量表示。1.3.2 華東覆盆子果、莖及葉的酚類物質的UPLC-MS/MS分析

1.3.2.1 樣品前處理

取1 mL提取液經0.22 μm微孔濾膜后轉移至進樣小瓶，用于UPLC-MS/MS分析。

1.3.2.2 標準溶液的配制

準確稱取山柰酚-3-O-蕓香糖苷，椴樹苷、蘆丁及鞣花酸標準品各10 mg，置于10 mL的容量瓶中，用甲醇溶液溶解定容至刻度，搖勻，過0.22 μm濾膜，制成1 mg/mL 溶液作為混合對照品溶液，在相同測定條件下，以標準品質量濃度為對照計算華東覆盆子果、莖及葉的目標物質的質量濃度。

1.3.2.3 色譜條件

采用ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱（2.1 mm×100 mm， 1.7 μm），流速0.30 mL/min。流動相A：含0.1%甲酸的超純水，流動相B：含0.1%甲酸的甲醇溶液。采用梯度洗脫：0～0.5 min，100%～95% A，0%～5% B；0.5～11.5 min，95%～5% A，5%～95% B；11.5～13.5 min，5%～95% A，95%～5% B。

1.3.2.4 質譜條件

使用電噴霧源在正離子模式進行質譜分析，測定質量范圍m/z50～1 200。重新校準時使用亮氨酸-腦啡肽（m/z556.28）鎖定質量選項。毛細管電壓為3.0 kV，樣品錐為40 V，初始溫度為120 ℃，脫溶氣體溫度為400 ℃，數據采集和處理采用Massynlyx4.1。

1.3.3 華東覆盆子果、莖及葉的抗氧化能力的測定

1.3.3.1 DPPH自由基清除能力測定

參照Chrysargyris等[16]的方法，對照品為Trolox，樣品提取液對DPPH自由基清除能力以清除率達到50%時（IC50，μg/mL）所需要的樣品質量濃度表示。DPPH自由基清除率按式（1）計算：

式中：A1為1 mL DPPH溶液、1.8 mL 70%甲醇溶液、0.2 mL樣品溶液混合的吸光度；A2為2.8 mL 70%甲醇溶液和0.2 mL樣品溶液混合的吸光度；A0為1 mL DPPH溶液和2 mL 70%甲醇溶液混合的吸光度。

1.3.3.2 ABTS陽離子自由基清除能力測定

參考Zhou Ying等[17]的方法，對照品為Trolox，樣品提取液對ABTS陽離子自由基清除能力以IC50表示。ABTS陽離子自由基清除率按式（2）計算：

式中：As為3.9 mL ABTS工作液和0.1 mL 70%甲醇溶液混合均勻的吸光度；Am為3.9 mL ABTS工作液和0.1 mL樣品溶液混合的吸光度。

1.3.3.3 FRAP測定

參照劉瑜新等[18]的方法，對照品為Trolox，FRAP以吸光度（A593nm）0.3時樣品質量濃度（A0.3，μg/mL）表示，A0.3越小，FRAP越大。

1.4 數據處理

各處理3 次重復，結果以±s表示，用SPSS Statistics 17.0及Excel進行數據統計分析，用Origin 9軟件繪圖。

2 結果與分析

2.1 不同部位的總酚、總黃酮和原花青素含量

表1 華東覆盆子果、莖、嫩葉和老葉的總酚、 總黃酮和原花青素含量（n= 3）Table 1 Contents of total phenols, total flavonoids and procyanidins in fruits, stems, tender leaves and old leaves of R. chingii Hu (n = 3)mg/g

由表1可知，華東覆盆子的果、莖、嫩葉和老葉總黃酮、總酚及原花青素含量具有顯著差異（P＜0.05）。嫩葉的總酚含量和總黃酮含量均高于果和莖，分別是果的2.28 倍和1.91 倍，莖的1.71 倍和1.51 倍，差異性顯著。與嫩葉相比，老葉的總酚含量比嫩葉低18.63%，而總黃酮含量最高，顯著高于其他部位；果的總黃酮含量和總酚含量與其他部位相比均最低，僅為莖的74.82%和78.95%，而原花青素顯著高于莖和葉（P＜0.05），分別是莖、嫩葉和老葉的2.61、3.04、4.04 倍；莖和嫩葉的原花青素含量相近，差異性不顯著（P＞0.05），分別是老葉原花青素含量的1.54 倍和1.32 倍?？傮w上，各部位間的總酚含量為嫩葉＞老葉＞莖＞果，總黃酮含量為老葉＞嫩葉＞莖＞果，而原花青素含量為果＞莖＞嫩葉＞老葉。

Veljkovic等[19]對巴爾干中部地區的野生樹莓種群研究發現葉的酚類含量高于果實，這與本實驗結果一致。賈仕杰[20]和寧瑋鈺[21]等研究了6 種東北紅樹莓葉的原花青素發現，葉中的原花青素含量在1.8～3.06 mg/g之間，低于果實和果籽中的原花青素的含量，這與本實驗果的原花青素含量高于莖葉的結果一致。而本實驗中嫩葉及老葉的原花青素含量略高于賈仕杰等[20]所測的結果，可能與區域差異及樣品采摘時間不同有關。

2.2 不同部位的酚類化合物分析

為進一步明確華東覆盆子各部位的酚類物質的具體組成，利用UPLC-MS/MS對提取液進行分析。由圖1可知，果、葉及莖的內在組分具有差異，而嫩葉和老葉的內在組分相似。如表2所示，UPLC-MS/MS共分析出了18 種黃酮類化合物和3 種酚酸，嫩葉和老葉的酚類化合物組成相似，主要為山柰酚衍生物和槲皮素及其衍生物，果和莖中的黃酮類成分相對于葉較少，這與曠慧[22]和肖洪明[23]等的研究結果相似。本研究對相對含量較高的化合物進一步定性定量分析（圖1～3、表3）。嫩葉中的山柰酚-3-O-蕓香糖苷和蘆丁含量最高，分別為莖的4.13 倍與23.25 倍，為果的4.38 倍與2 倍，不同部位間差異顯著。莖中的椴樹苷含量較高，為果的4.21 倍及老葉的6.65 倍，而與嫩葉差異不顯著（P＞0.05）。實驗發現果中的鞣花酸含量最高，達到了1 165.69 μg/g，分別為莖的1.57 倍、嫩葉的6.31 倍和老葉的4.82 倍，差異較大。老葉的沒食子酸含量最高，達到了24.97 μg/g，與果差異顯著，嫩葉和莖中的含量較少，無明顯差異。

圖1 樣品的總離子流圖Fig. 1 Total ion current chromatograms of polyphenols in different parts of R. chingii Hu

圖3 各標品的質譜碎片圖Fig. 3 Mass spectrum of each standard

表2 華東覆盆子果、莖、嫩葉和老葉的酚類化合物鑒定結果（n= 3）Table 2 Identification of phenolic compounds in fruits, stems, young leaves and old leaves of R. chingii Hu (n= 3)

表3 華東覆盆子果、莖、嫩葉和老葉的3 種黃酮和 2 種酚酸含量（n= 3）Table 3 Contents of three flavonoids and two phenolic acids in fruits, stems, tender leaves and old leaves of R. chingii Hu (n= 3)μg/g

2.3 抗氧化活性分析

DPPH法、ABTS法及FRAP法是評價體外抗氧化活性最可靠的方法之一，主要原理為抗氧化物質對自由基的清除能力以及對金屬離子的還原能力，具有成本低廉、應用廣泛、操作便利等優勢[24-25]。研究發現，華東覆盆子果、莖、嫩葉及老葉的70%甲醇提取物均具有抗氧化活性，且嫩葉的DPPH自由基清除能力、ABTS陽離子自由基清除能力、FRAP均大于果、莖及老葉，具有最強的抗氧化活性，這與Veljkovic等[19]研究的結果一致。Ding[26]用DPPH法研究華東覆盆子果的抗氧化活性時，發現其IC50為17.9 μg/mL，強于抗壞血酸（IC50為23.2 μg/mL）。 吳峰華等[9]研究了華東覆盆子果不同提取部位的DPPH自由基清除能力，發現醇提物的IC50為17.7 μg/mL， 略高于BHT（12.5 μg/mL），與表4所示果的IC50（42.41 μg/mL）略有區別，可能是因為所測樣品的產地來源及采收時間不同所致。Wang等[27]研究了黑莓、草莓以及5 種懸鉤子屬植物的嫩葉及老葉酚類含量和抗氧化活性，發現葉片的酚類含量和抗氧化活性高于果實，葉片中嫩葉的酚類含量和抗氧化活性又遠高于老葉，與本實驗所測結果一致。

表4 華東覆盆子果、莖、嫩葉及老葉提取物的抗氧化活性比較（n=3）Table 4 Antioxidant activities of extracts from fruits, stems, tender leaves and old leaves of R. chingii Hu (n= 3)

2.3.1 DPPH自由基清除能力分析

圖4 4 種樣品提取物的DPPH自由基清除能力Fig. 4 DPPH-scavenging activities of four sample extracts

如圖4所示，當樣品質量濃度逐漸增加時，4 種樣品提取物的DPPH自由基清除速率呈現快速上升后趨于平緩的趨勢，當清除率低于90%時，樣品的自由基清除率與質量濃度具有明顯的量效關系。其中，嫩葉的清除能力最強，在質量濃度為40 mg/mL時，清除率達到了91%，其IC50為16.99 μg/mL，清除能力弱于對照Trolox （4.84 μg/mL）；其次是老葉提取物（22.61 μg/mL）和莖提取物（29.94 μg/mL），果提取物清除能力較弱，IC50值最高（42.41 μg/mL），是嫩葉提取物的2.49 倍，老葉的1.87 倍及莖的1.40 倍，與其他部位具有明顯差異。

2.3.2 ABTS陽離子自由基清除能力分析

如圖5 所示，華東覆盆子果、莖、嫩葉及老葉的ABTS陽離子自由基清除能力變化趨勢與DPPH自由基清除能力的變化趨勢相似，在樣品質量濃度為30～1 800 μg/mL時，隨著樣品的質量濃度增加，ABTS陽離子自由基清除率逐漸上升，具有明顯的劑量依賴性。果的IC50在4 種樣品提取液中最高，說明果的自由基清除能力最低，嫩葉的自由基清除能力最強，IC50僅為514.00 μg/mL，約為果的1/3，與果、莖及老葉達到了顯著差異，而老葉的IC50值小于莖，說明老葉的清除能力強于莖，總體看來，ABTS陽離子自由基清除能力大小依次為嫩葉＞老葉＞莖＞果。

圖5 4 種樣品提取物的ABTS陽離子自由基清除能力Fig. 5 ABTS cation radical scavenging activities of four extracts

2.3.3 FRAP分析

圖6 4 種樣品提取物的FRAP Fig. 6 Ferric ion reducing power of four extracts

如圖6可知，提取物的吸光度的變化趨勢與前面2 種抗氧化評估方法變化趨勢相同。4 種提取物A0.3依次為果＞莖＞老葉＞嫩葉，其中嫩葉的還原能力最強，A0.3值最小，僅為39.06 μg/mL，其次是老葉和莖，A0.3值為46.51 μg/mL和58.80 μg/mL，果的總還原能力較差，具有最高的A0.3值?？傮w看來，FRAP大小依次為嫩葉＞ 老葉＞莖＞果。

2.4 華東覆盆子果、莖、嫩葉及老葉提取物的化學成分成分與抗氧化活性的相關性分析

表5 華東覆盆子果、莖、嫩葉及老葉提取物活性成分與其 抗氧化活性的相關性分析Table 5 Correlation analysis between bioactive components and antioxidant capacity of extracts from fruits, stems, tender leaves and old leaves of R. chingii Hu

以樣品質量濃度40 μg/mL測定DPPH自由基清除率；以樣品質量濃度測1 500 μg/mL定ABTS陽離子自由基清除率。如表5所示，總酚含量與DPPH自由基清除能力有極顯著相關性，與ABTS陽離子自由基清除能力及FRAP顯著相關，說明各部位的抗氧化活性與總酚含量顯著相關，即總酚對各部位的抗氧化活性的貢獻最大，鞣花酸是漿果類的主要酚酸，研究發現鞣花酸和沒食子酸是華東覆盆子的主要酚酸[28]。鞣花酸含量、沒食子酸含量及原花青素含量與DPPH自由基清除能力、ABTS陽離子自由基清除能力及FRAP都呈負相關，說明鞣花酸、沒食子酸及原花青素對總酚的抗氧化活性無顯著貢獻。原因一可能是果實與莖葉的成分種類和含量的差異較大[28-29]，果實中的鞣花酸和原花青素含量雖然高于嫩葉和老葉，但是總黃酮含量和種類遠低于嫩葉和老葉，由此導致果和莖的抗氧化能力小于嫩葉和老葉，使相關性分析出現了負值。原因二可能是原花青素自身發生了氧化聚合，從而減弱了自身的抗氧化活性，這與代沙[30]研究發現紫蘇的原花青素含量和脂質過氧化抑制率呈負相關的結果一致。酚類化合物除了酚酸和原花青素，還包括黃酮化合物[31]。實驗發現總黃酮含量與DPPH自由基、ABTS陽離子自由基清除能力及FRAP相關性達到了0.900、0.863及0.835；山柰酚-3-O-蕓香糖苷與DPPH自由基、ABTS陽離子自由基清除能力及FRAP相關性也達到了0.9以上，且總黃酮含量與總酚含量相關性達到了0.914，山柰酚-3-O-蕓香糖苷與總酚含量顯著相關。說明總酚的抗氧化活性極可能是由總黃酮所貢獻，這與賈仕杰等[20]得出東北樹莓總酚的抗氧化活性是由總黃酮呈了較高貢獻作用的結論一致。由于實驗中存在未知酚類物質的影響，無法斷定鞣花酸和總原花青素對總酚的抗氧化活性影響是否起到了相反的作用，因此仍需深入研究。

3 結 論

華東覆盆子果、莖、嫩葉及老葉含有豐富的酚類化合物，相對于果和莖，葉具有更高含量的總酚和總黃酮，其中的山柰酚-3-O-蕓香糖苷及蘆丁等黃酮類成分含量也最高。而莖中具有較高含量的椴樹苷，果中的鞣花酸含量最高，果、莖及葉可作為這些化合物的提取潛在來源。體外抗氧化結果表明華東覆盆子嫩葉及老葉的抗氧化活性大于莖和果，嫩葉的抗氧化能力強于老葉。相關性顯示，總酚對抗氧化活性貢獻最高，因此，嫩葉的酚類化合物可作為潛在的天然抗氧化劑，具有一定的保健品開發潛力。