FYa1泡菜用直投式發(fā)酵劑的制作工藝優(yōu)化

康 嬌，張亞蓉，楊從緒，薛橋麗，胡永金,

（1.云南農業(yè)大學食品科學技術學院，云南 昆明 650201；2.云南農業(yè)大學學報編輯部，云南 昆明 650201）

云南傳統泡菜發(fā)酵加工工藝簡單，受發(fā)酵速度、品質等方面受自然條件的影響大，且泡菜菌種和產品不穩(wěn)定、亞硝酸鹽含量高等諸多問題嚴重的制約著云南泡菜的發(fā)展。Pederson等[1]在1961年第一次把純種發(fā)酵技術應用于泡菜的生產研究中。國內對直投式發(fā)酵劑到20世紀90年代才開始進行，到目前為止商業(yè)化生產發(fā)酵劑的公司還比較少，很多企業(yè)還只能依靠進口購買發(fā)酵劑，因此發(fā)酵劑市場大部分依然被國外制備發(fā)酵劑的公司所占據[2-3]。

直投式乳酸菌發(fā)酵劑是采用優(yōu)質乳酸菌進行液體高密度培養(yǎng)后，經過菌體細胞分離，與保護劑介質混溶制備高濃度菌懸液，再經冷凍干燥、無菌包裝后制成的一系列高濃度和標準化的發(fā)酵劑菌種[4]，具有活力高、接種量少、可直接應用于生產等特點[5]。直投式乳酸菌發(fā)酵劑是目前發(fā)酵工業(yè)的一個研究熱點[6]。乳酸菌發(fā)酵劑的制備方法常使用真空冷凍干燥[7]，為降低冷凍干燥過程中細胞的死亡率，利用凍干保護劑可對細胞起到一定的保護 作用[8-9]，在凍干過程中，減輕或防止冷凍干燥時對菌體細胞物理、化學損傷或復水時對細胞的損害，保持原有的多種生物活性和各種理化特性，從而提高菌體存活率[10-11]。

從云南富源泡菜中分離得到的發(fā)酵乳桿菌FYa1，具有較高胞外多糖產量（約為175 mg/L），而許多胞外多糖都具有抗腫瘤[12-13]、抗氧化[14-16]、免疫調節(jié)[17-19]、降膽 固醇[20-21]、降血壓[22]、增強黏膜吸附作用[23]等生物活性。本研究旨在開發(fā)生長速度快、發(fā)酵活力高、發(fā)酵風味好、亞硝酸鹽降解能力強的泡菜優(yōu)良發(fā)酵劑，為云南傳統泡菜科學加工和產品質量提升提供一定科學理論和應用依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌種

發(fā)酵乳桿菌（Lactobacillus fermentum）FYa1分離于云南富源酸菜，4 ℃斜面保存。

1.1.2 試劑

脫脂乳粉、海藻糖、蔗糖、葡萄糖、谷氨酸鈉、谷氨酸、甘油、甘露醇（均為分析純） 天津市風船化學試劑科技有限公司；平板計數培養(yǎng)基、MRS肉湯培養(yǎng)基 廣東環(huán)凱微生物科技有限公司。

1.2 儀器與設備

TGL 20M型冷凍離心機 湖南湘立科學儀器有限公司； FD-1A-50冷凍干燥機 上海比郎儀器制造有限公司。

1.3 方法

1.3.1 直投式泡菜發(fā)酵劑的工藝流程及操作要點

1）菌種活化：分離純化得到的優(yōu)勢菌株接種到MRS液體培養(yǎng)基中，37 ℃、120 r/min的搖床中培養(yǎng)24 h，連續(xù)活化2 次，得活化菌種。

2）菌種擴大培養(yǎng)：將活化的菌種按3%的接種量接種至優(yōu)化的MRS液體培養(yǎng)基中，37 ℃、120 r/min的恒溫搖床中培養(yǎng)48 h。

3）離心收集菌泥：選擇適合的離心條件，盡量降低離心損失率和冷凍干燥時造成的細胞死亡率。以離心轉速、時間和溫度為參數，取發(fā)酵液至已滅菌的離心管中，離心后，棄上清液收集菌泥。加入等體積無菌生理鹽水打散混勻后，做梯度稀釋，選取適合濃度梯度，采用平板計數法測定FYa1活菌數。

4）菌懸液的制備：將凍干保護劑溶解制成相應濃度的溶液，121 ℃滅菌15 min備用。發(fā)酵液離心后棄去上清液，菌泥中分別加入配制滅菌后的保護劑，保護劑添加量為離心前菌液體積的1/10，混合均勻。菌懸液配制好后采用梯度稀釋平板法進行活菌計數。

5）預冷凍：在真空冷凍干燥菌種的過程中，微生物存活率與凍結速度有極其重要的關系。為提高乳酸菌對低溫環(huán)境的適應能力，將制備好的菌懸液放入-80 ℃冷凍室4 h[24]，進行預冷凍，使其凍結均勻。

6）真空冷凍干燥：待菌懸液凍結完全后，迅速取出轉移至真空冷凍干燥機內，開啟真空泵，直至形成干燥菌粉。凍干條件為真空度9.7 Pa、冷阱溫度-50 ℃，凍干時間約18 h。凍干后取干燥菌粉測定活菌總數，計算凍干存活率。

7）活菌計數：凍干后的菌粉，加入與保護劑相同體積無菌水溶解，采用梯度稀釋法，選擇合適的稀釋度，在37 ℃下恒溫培養(yǎng)48 h，進行活菌計數。

1.3.2 直投式泡菜發(fā)酵劑離心條件的篩選

采用單因素配合正交試驗，以FYa1離心存活率作為測量指標，優(yōu)化發(fā)酵劑的離心條件。

1.3.2.1 單因素試驗

考察離心轉速（2 000、4 000、6 000、8 000 r/min）對FYa1存活率的影響時，固定離心溫度4 ℃、離心時間10 min。選取離心存活率較高轉速，在一定離心溫度（4、10、15、20、25 ℃）下，離心10 min。在之前實驗的基礎上，選取離心存活率較高轉速和離心溫度，比較在不同離心時間（10、20、30、40 min）下，FYa1的離心存活率。計算不同離心條件下FYa1的離心存活率。

1.3.2.2 正交試驗

根據單因素試驗結果，采用L9（34)正交試驗，對離心轉速、離心溫度、離心時間進行優(yōu)化，確定FYa1的最佳離心條件。正交因素與水平設計見表1。

表1 發(fā)酵劑離心條件正交試驗因素與水平Table 1 Level and code of independent variables used for orthogonal array design

1.3.3 直投式泡菜發(fā)酵劑冷凍干燥保護劑的復配優(yōu)化

1.3.3.1 Plackett-Burman試驗

Plackett-Burman試驗設計用于Box-Behnken試驗前挑選優(yōu)化因素。結合參考文獻[25-26]對影響乳酸菌冷凍干燥存活率的相關因素，對脫脂乳粉、海藻糖、蔗糖、葡萄糖、谷氨酸鈉、谷氨酸、甘油、甘露醇進行初步考察，檢測凍干存活率。因素與水平設計見表2。

表2 發(fā)酵劑冷凍干燥保護劑水平Table 2 Code and level of independent variables used for Plackett-Burman design%

1.3.3.2 Box-Behnken設計優(yōu)化最佳保護劑配方

根據Plackett-Burman試驗設計的結果，從中選取海藻糖、蔗糖、谷氨酸鈉用量為影響凍干存活率的3 個主要因素，以凍干存活率作為響應值（Y），設計Box-Behnken試驗，確定最佳凍干保護劑的配方。試驗因素及水平設計見表3。

表3 Box-Behnken試驗因素與水平Table 3 Code and level of independent variables used for Box-Behnken design g/100 mL

1.3.4 直投式泡菜發(fā)酵劑的發(fā)酵性能檢測

為探究直投式泡菜發(fā)酵劑在實際發(fā)酵中的發(fā)酵活性，將優(yōu)化后所得直投式發(fā)酵劑接種到蘿卜泡菜中進行發(fā)酵。

1.3.4.1 泡菜制備

以蘿卜為原料，均勻切成邊長2 cm正方體形，開水漂燙1 min，瀝水備用。將處理好的蘿卜以1 kg每瓶分裝于泡菜瓶中，按料液比1∶1（kg/L）加入水，添加質量分數0.03%直投式泡菜發(fā)酵劑（添加前溫水復活30 min），37 ℃發(fā)酵，取前中后末期樣品各1 次，直至發(fā)酵終點。測定泡菜發(fā)酵過程中微生物指標（菌落總數、霉菌、酵母、乳酸菌及致病菌）。

1.3.4.2 微生物指標測定

菌落總數參照GB 4789.2—2016《食品微生物學檢測 菌落總數測定標準》[27]；霉菌和酵母總數的測定采用平板計數法，參照GB 4789.15—2016《食品微生物學檢測 霉菌和酵母菌計數標準》[28]；大腸菌群參照GB 4789.3—2010《食品微生物學檢測 大腸菌群計數》[29]；乳酸菌參照GB 4789.35—2016《食品微生物學檢測 乳酸菌總數測定標準》[30]。

1.4 數據分析

使用SPSS 18.0、Minitab 17進行試驗設計與統計分析；采用Origin制作圖表。

2 結果與分析

2.1 直投式泡菜發(fā)酵劑離心條件的篩選

2.1.1 單因素試驗結果

圖1 離心轉速（A）、離心溫度（B）以及離心時間（C）對 FYa1存活率的影響Fig. 1 Effects of centrifugation speed (A), temperature (B) and time (C) on survival rate of FYa1

由圖1可知，FYa1存活率隨轉速的升高，呈先上升后下降的趨勢，在4 000 r/min時存活率達到峰值，后離心存活率持續(xù)下降。離心存活率隨著離心溫度的升高總體呈下降趨勢，存活率在4～15 ℃時處于較高水平。隨著離心時間的延長離心存活率總體呈下降趨勢，離心達40 min時，有小幅上升現象，但幅度不大。故綜合考量，選取轉速4 000 r/min、離心溫度4～15 ℃、離心時間10 min進行后續(xù)正交試驗，優(yōu)化離心條件。

2.1.2 正交試驗優(yōu)化發(fā)酵劑離心條件

離心轉速、離心時間、離心溫度極差分別為4.754、20.037、7.620，極差越大表明該因素對FYa1離心存活率的影響越顯著，因此離心條件對菌株的離心存活率的影響的主次順序依次為：離心時間＞離心溫度＞離心轉速。由k值 可知，離心條件各因素的最佳組合為A1B3C3，即離心轉速3 000 r/min、離心時間15 min、離心溫度15 ℃，在這個條件下，FYa1離心存活率達到了34.57%（表4）。

表4 發(fā)酵劑離心條件正交試驗設計及結果Table 4 Orthogonal array design with experimental results for optimization of centrifugation conditions

2.2 直投式泡菜發(fā)酵劑冷凍干燥保護劑的復配優(yōu)化

2.2.1 Plackett-Burman試驗結果

表5 Plackett-Burman試驗設計及結果Fig. 5 Plackett-Burman design with experimental results

通過Plackett-Burman試驗設計，對脫脂乳粉、海藻糖、蔗糖、葡萄糖、谷氨酸鈉、谷氨酸、甘油、甘露醇8 種凍干保護劑進行初步考察，篩選出對FYa1凍干存活率影響較顯著的因素，試驗設計及FYa1凍干存活率響應值結果見表5。FYa1凍干存活率在38.7%～62.3%之間，經方差分析后，可分析各干燥劑對FYa1凍干存活率的影響，從而篩選出主要影響因素。

表6 Plackett-Burman試驗結果方差分析Table 6 Analysis of variance of Plackett-Burman design results

從表6可知，除葡萄糖、谷氨酸和甘露醇對FYa1凍干存活率的影響為負效應外，其他均表現為正效應，并且海藻糖、蔗糖、谷氨酸鈉3 個因素的效應值最大，且P值均小于0.05，表明海藻糖、蔗糖、谷氨酸鈉對FYa1凍干存活率影響顯著，其他因素則沒有顯著性差異。

圖2 標準化效應Pareto圖Fig. 2 Pareto chart of the standardized effect

由圖2可知，各因素對FYa1的凍干存活率影響顯著程度依次為：海藻糖＞蔗糖＞谷氨酸鈉＞葡萄糖＞甘油＞谷氨酸＞脫脂乳粉＞甘露醇。其中，海藻糖、蔗糖、谷氨酸鈉對響應值影響顯著（P＜0.05），是決定FYa1凍干存活率的重要因素。因此選擇海藻糖、蔗糖、谷氨酸鈉作為主要影響因素，進行進一步的Box-Behnken響應面設計，優(yōu)化復配冷凍干燥保護劑。

2.2.2 Box-Behnken設計優(yōu)化最佳保護劑配方

根據Plackett-Burman試驗設計結果，進一步用Box-Behnken響應面法優(yōu)化凍干保護劑的配方，以FYa1凍干存活率（Y）為響應值，試驗設計與結果如表7所示。

表7 凍干保護劑Box-Behnken響應面試驗設計及結果Table 7 Box-Behnken design with experimental results

采用Minitab17軟件對數據進行二次多項回歸擬合，獲得FYa1凍干存活率的二次回歸擬合多項式方程為：Y對回歸方程進行方差分析，結果見表8。

表8 響應面方差分析結果Table 8 Analysis of variance of Box-Behnken design results

該模型顯著（P=0.005 7＜0.01），失擬不顯著（P=0.491 3＞0.05），模型的F值為13.02，該模型的R2為0.959 1、R2Adj為0.885 4表明試驗所采用的模型擬合程度良好，在統計學上有意義。各因素中、、對響應值凍干存活率影響極顯著（P＜0.01），其余因素對凍干存活率影響并不顯著（P＞0.05）。各因素與響應值凍干存活率之間的關系可以通過回歸方程描述，可以利用該模型預測凍干保護劑的配方和菌體凍干存活率。海藻糖、蔗糖和谷氨酸鈉對FYa1凍干存活率影響的等高線和響應面如圖3所示。

圖3 各因素交互作用下FYa1凍干存活率的等高線和響應面圖Fig. 3 Contour and response surface plots showing the interactive effects of trehalose, sucrose and sodium glutamate on the survival rate of lyophilized FYa1

分析回歸方程Y，得到8.5 g/1 00 mL海藻糖、8.5 g/100 mL蔗糖和2.5 g/100mL谷氨酸鈉時的最大響應值。通過驗證實驗驗證模型方程預測最優(yōu)響應值的適用性。凍干菌粉的存活率為（68.53±0.09）%，此時測得FYa1發(fā)酵劑的含菌量為（2.0±0.05）×108CFU/g。

2.3 直投式泡菜發(fā)酵劑的發(fā)酵性能

FYa1發(fā)酵劑及老湯發(fā)酵的泡菜，發(fā)酵過程各微生物指標測定結果如表9所示。FYa1發(fā)酵劑泡菜的菌落總數在第0小時為2.8×105CFU/mL，隨時間的延長泡菜中細菌迅速增殖，10 h菌落總數略微下降，之后趨于平穩(wěn)。乳酸菌數在第0小時為9.7×104CFU/mL，經過5 h發(fā)酵后，發(fā)酵劑泡菜中乳酸菌數增加至6.7×108CFU/mL，之后基本趨于穩(wěn)定。酵母菌數隨發(fā)酵進行不斷減少，10 h后直至發(fā)酵結束都未被檢測出。發(fā)酵過程中均未檢測出霉菌與大腸菌群。

表9 微生物指標變化Table 9 Changes in microbial populations in the DVS during pickle fermentation

綜合分析，雖然發(fā)酵前期FYa1發(fā)酵劑泡菜中菌落總數與酵母菌數較少，但隨著發(fā)酵進行，FYa1迅速成為優(yōu)勢菌群，累積乳酸降低發(fā)酵環(huán)境中的酸度，從而抑制其他雜菌，比如酵母菌的生長，故第10小時未檢測出酵母菌以至于菌落總數出現略微降低。這證明FYa1發(fā)酵劑具有優(yōu)秀的發(fā)酵性能，在發(fā)酵過程中展現出良好的復活能力。

3 結 論

FYa1直投式泡菜發(fā)酵劑的最佳離心條件為離心轉速3 000 r/min、離心時間15 min、離心溫度15 ℃，在此條件下，FYa1離心存活率達到了34.57%。凍干保護劑的最佳配比為8.5 g/100 mL海藻糖、8.5 g/100 mL蔗糖和2.5 g/m L 谷氨酸鈉，凍干菌粉的存活率為（68.53±0.09）%，此時測得FYa1直投式泡菜發(fā)酵劑的含菌量為（2.0±0.05）×108CFU/g。FYa1直投式泡菜發(fā)酵劑具有優(yōu)秀的發(fā)酵性能，在發(fā)酵過程中展現出良好的復活能力。