呋喃它酮代謝物單鏈抗體制備和酶聯(lián)免疫分析方法

楊武英，王 弘，洪艷平，王 丹，徐振林，沈玉棟，柯法鈞，陳薪竹，孫遠明,

（1.南昌市農產品加工與質量控制重點實驗室，江西農業(yè)大學食品科學與工程學院，江西 南昌 330045；2.廣東省食品質量安全重點實驗室，華南農業(yè)大學食品學院，廣東 廣州 510642）

獸藥殘留嚴重影響動物性食品的安全，威脅消費者的身體健康，制約我國動物性食品的出口。養(yǎng)殖戶在動物飼養(yǎng)過程中不遵守休藥期的規(guī)定、非法使用違禁藥物、濫用抗菌藥物和飼料添加劑是造成動物性食品獸藥殘留超標的主要原因。呋喃它酮是人工合成的硝基呋喃類廣譜抗生素，有很好的消炎抑菌及促進動物生長的作用，曾被廣泛應用于畜禽和水產養(yǎng)殖業(yè)。有關研究證明呋喃它酮原藥及其代謝物具有相當大的毒性和致癌致畸致突變作用[1-2]。鑒于呋喃它酮及其代謝物的危害性，1995年起歐美多國禁止其在動物生產中使用，我國2002年也規(guī)定動物性食品中不得檢出[3-4]。由于呋喃它酮藥效好、合成比較容易、價格便宜，受經濟利益驅使，目前包括中國在內的很多國家非法使用仍然比較嚴重，所以加強對動物性食品中呋喃它酮及其代謝物的檢測監(jiān)控顯得十分緊迫和必要[5-6]。

呋喃它酮原藥攝入到動物體內后迅速被分解代謝，難以直接檢測，其代謝物卻能迅速結合動物組織中的蛋白質，可以穩(wěn)定存在6～8 個星期，常用的食物制作方法如烹飪、烘焙、微波等均無法使其降解。動物性食品中的呋喃它酮代謝物殘留在人類胃的酸性環(huán)境中可以通過水解釋放出來，被吸收進入體內對人類健康造成危害[7]。因此測定動物組織中代謝物殘留比檢測呋喃它酮原藥更具有現(xiàn)實意義。呋喃它酮的代謝物是5-嗎啉甲基-3-氨基-2-惡唑烷基酮（5-morpholinemethyl-3-amino-2-oxazolidinone，AMOZ），獸藥殘留監(jiān)測部門通常將AMOZ作為監(jiān)測呋喃它酮殘留的標示物。

AMOZ的檢測方法主要有儀器分析法[8-14]和免疫分析法[15-23]。儀器分析法具有準確、靈敏、特異性好和假陽性率低的優(yōu)點，但存在檢測速度慢、需要昂貴儀器和專業(yè)操作人員等不足，難以滿足目前高通量、快速、現(xiàn)場檢測的需要，不易普及推廣。免疫分析法具有操作簡便、靈敏度高、特異性強、高通量、低成本等優(yōu)勢，容易實現(xiàn)現(xiàn)場快速檢測，適合大量樣品的快速篩查，彌補了AMOZ殘留儀器分析法的不足。

抗體制備是免疫分析法的關鍵技術之一，抗體的制備技術經歷了多克隆抗體制備、單克隆抗體制備、基因工程抗體制備3 個發(fā)展階段。單鏈抗體（singlechain variable fragment，scFv）是由一段柔性的小肽鏈（linker）將抗體重鏈可變區(qū)（heavy chain variable fragment，VH）基因、輕鏈可變區(qū)（light chain variable fragment，VL）基因首尾相接表達得到的一種重要的小分子基因工程抗體，具有和母本抗體相近的特異性和親和力，通過微生物發(fā)酵可以快速大量制備，制備技術較簡單，生產周期短、成本低，近年來在農獸藥殘留免疫檢測方面展示了廣闊的應用前景。目前文獻報道的AMOZ殘留免疫檢測方法都是利用傳統(tǒng)的多抗或單抗建立的，利用基因工程scFv建立的酶聯(lián)免疫吸附分析法鮮見報道。本實驗從前期獲得的抗AMOZ衍生物單克隆抗體陽性雜交瘤細胞出發(fā)，采用基因工程抗體技術，開展抗AMOZ衍生物重組scFv制備及基于scFv的AMOZ殘留間接競爭酶聯(lián)免疫吸附分析方法（indirect competitive enzyme-linked immunosorbent assay，icELISA）研究，并用高效液相色譜-串聯(lián)質譜（high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry，HPLC-MS/MS）） 法對建立的icELISA方法進行驗證。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

基圍蝦購于當?shù)爻校涷炞C為陰性樣品。

5-甲基嗎啉-3-(乙醛氨基)-2-惡唑烷基酮-卵白蛋白（5-morpholinomethyl-3-(glyoxalamino)-2-oxazolidinoneovalbumin，AMOZA-OVA）包被原、抗AMOZ衍生物單克隆抗體陽性雜交瘤細胞6E2由本研究室制備保存；抑制藥物5-甲基嗎啉-3-(2-硝基芐基氨基)-2-唑烷基酮（5-morpholinomethyl-3-(2-nitrobenzylidenamino)-2-oxazolidinone，NPAMOZ）、硝基呋喃類抗生素及其代謝物標準品 德國Merck公司；聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）引物 上海英駿生物技術有限公司（表1）；質粒提取試劑盒 北京天根生物技術有限公司；各種工具酶 美國Fermetas 公司；鼠抗His標簽單克隆抗體、羊抗鼠IgG-HRP 北京 全式金生物技術有限公司；大腸桿菌BL21（DE3）、 pET-22b（＋）載體由本研究室保存；Ni親和柱 美國GE Healthcare公司；其他試劑均為進口或國產分析純及色譜純。

表1 VH和VL基因的擴增引物 Table 1 Primer sequences used for PCR amplification of VH and VL genes

1.2 儀器與設備

PCR擴增儀、DNA電泳設備、GDS7500型凝膠成像系統(tǒng)、半干轉印儀 美國Bio-Rad公司；DM 530核酸蛋白分析儀 美國Beckman公司； Ni-NAT親和柱 德國Novagen公司；Multiskan MK3多功能酶標儀 美國Thermo公司；1200-6410A型HPLCMS/MS聯(lián)用儀 美國Agilent公司。

1.3 方法

1.3.1 抗AMOZ衍生物scFv基因構建和鑒定

復蘇抗AMOZ衍生物單克隆抗體陽性雜交瘤細胞，用Trizol試劑提取總RNA，逆轉錄PCR擴增抗體VH和VL基因，通過(G1y4Ser)3連接肽采用重疊延伸聚合酶鏈式反應（splicing overlap extension-polymerase chain reaction，SOE-PCR）技術構建抗AMOZ衍生物scFv基因，再把該基因克隆到表達載體pET-22b（＋）上并轉化到大腸桿菌BL21（DE3）中，提取重組轉化子質粒進行雙酶切及PCR擴增鑒定，將鑒定正確的陽性重組子質粒送基因公司進行測序[24]。

1.3.2 抗AMOZ衍生物scFv表達、純化和活性鑒定

搖瓶培養(yǎng)抗AMOZ衍生物scFv陽性克隆菌，采用異丙基β-D-硫代半乳糖苷（isopropylβ-Dthiogalactopyranoside，IPTG）進行誘導表達，十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）和Western blotting鑒定抗體的表達，Ni親和柱純化scFv蛋白，最后得到的scFv分裝，于-20 ℃貯存?zhèn)溆谩２捎肂radford法測定scFv質量濃度，通過12% SDS-PAGE采用Quantity one凝膠分析軟件測定scFv純度，采用間接ELISA測定scFv的效價，采用間接競爭ELISA測定scFv的活性[25-27]。

1.3.3 icELISA檢測方法的建立和方法特異性評價

用一定濃度的AMOZA-OVA包被原包被酶標板，每孔100 μL，37 ℃溫育過夜，甩干孔內液體，用洗液洗滌3 次后每孔加入120 μL封閉液，37 ℃封閉3 h，洗滌3 次后將酶標板于37 ℃烘干備用；取出需要數(shù)量的微孔板，每孔加入50 μL抗AMOZ衍生物scFv稀釋液和50 μL抑制藥物NPAMOZ稀釋液，輕輕振蕩混勻，37 ℃孵育45 min后取出洗板5 次，拍干；每孔加100 μL稀釋一定倍數(shù)的抗His標簽抗體，輕輕振蕩混勻，37 ℃孵育45 min后取出洗板5 次，拍干；每孔加入100 μL HRP-羊抗鼠IgG，輕輕振蕩混勻，37 ℃孵育45 min后取出洗板5 次，拍干；每孔加入顯色液100 μL，37 ℃顯色10 min；每孔加入50 μL的終止液（10% H2SO4）終止反應，用酶標儀測定450 nm波長處的光密度（optical density，OD）值。采用棋盤滴定實驗優(yōu)化AMOZA-OVA包被原包被濃度和scFv稀釋度。在優(yōu)化的實驗條件下，以NPAMOZ質量濃度的對數(shù)為橫坐標，B/B0為縱坐標（B為添加NPAMOZ時的OD值，B0為不添加NPAMOZ時的OD值），采用OriginPro 8.5軟件按照四參數(shù)對數(shù)擬合繪制NPAMOZ標準曲線。選擇與NPAMOZ結構相似的其他硝基呋喃類抗生素及其代謝物對建立的icELISA方法進行特異性評價。

1.3.4 樣品前處理方法的初步確定

參考文獻[28]并做一定的改進。步驟如下：新鮮蝦肉剁碎成肉末，再用組織搗碎機搗碎樣品成為均質， -20 ℃保存?zhèn)溆谩７Q取1 g均質好的蝦肉樣品于離心管中，加入4 mL的蒸餾水，0.5 mL 1 mol/L的HCl溶液和100 μL樣本衍生試劑，充分振蕩，37 ℃恒溫水浴條件下孵育過夜；取出后加入0.4 mL 1 mol/L NaOH溶液，5 mL 0.1 mol/L K2HPO4溶液和5 mL的乙酸乙酯，劇烈振蕩30 s，5 000 r/min離心10 min，乙酸乙酯再重復提取一次；2 次乙酸乙酯層取出合并于另一離心管中，氮氣吹干，用1 mL的正己烷溶解干燥物，再加0.5 mL含吐溫-20的磷酸鹽緩沖溶液，輕輕振蕩混勻，5 000 r/min離心10 min，下層液體用于icELISA分析。

1.3.5 AMOZ衍生條件的優(yōu)化

實際動物性食品樣品中殘留的是代謝物AMOZ，添加回收實驗中添加物也是代謝物AMOZ，需要用衍生試劑硝基苯甲醛（nitrobenzaldehyde，NBA）把AMOZ衍生成NPAMOZ才能進行免疫檢測。因為前處理時樣品中的AMOZ不可能100%衍生為NPAMOZ，所以衍生率的高低對實驗結果影響很大。本實驗以AMOZ標準品作為研究對象進行衍生條件的優(yōu)化研究，在衍生率測定時只添加AMOZ標準品，不添加實際樣品，按照1.3.4節(jié)方法進行前處理，采用icELISA檢測NPAMOZ的量，再換算為AMOZ標準品的量，測定所得AMOZ標準品的量除以實際添加AMOZ標準品的量得AMOZ的衍生率。對衍生試劑種類、衍生試劑用量、衍生溫度、衍生時間等影響衍生率的關鍵因素進行優(yōu)化，選取最優(yōu)衍生條件進行1.3.6節(jié)中實際樣品添加回收率的測定。

1.3.6 添加回收率的測定

稱取1 g均質好的陰性蝦肉樣品于離心管中，分別按100、50、10、3 ng/g的比例添加AMOZ標準品溶液，每個添加水平做3 個平行，按照1.3.5節(jié)優(yōu)化后的衍生條件進行AMOZ衍生操作，再對衍生得到的NPAMOZ進行提取和凈化處理，最后用icELISA測定NPAMOZ實際檢出量，再換算成AMOZ回收檢出量，計算回收率。用不添加AMOZ標樣的蝦肉樣品做陰性對照，前處理方法同加標樣品。將NPAMOZ實際檢出量（mNPAMOZ）代入下式計算AMOZ回收檢出量（mAMOZ）：

式中：mNPAMOZ為NPAMOZ實際檢出量/ng；MNPAMOZ為NPAMOZ的相對分子質量；MAMOZ為AMOZ的相對分子質量；N為AMOZ衍生為NPAMOZ的衍生率/%。

1.3.7 HPLC-MS/MS方法驗證

蝦肉樣品前處理同1.3.6節(jié)，采用外標法進行HPLCMS/MS方法驗證[29-30]，HPLC-MS/MS測定結果和icELISA測定結果進行相關性分析。

色譜條件：色譜柱為ZORBAX SB-C18（2.1 mm× 150 mm，3.5 μm）；流動相由0.1%甲酸（A）和乙腈（B）組成，梯度洗脫程序為：0 min，22% B、78% A；0～6 min，22%～99% B、78%～1% A；6～9 min，99% B、1% A；9～9.1 min，99%～22% B、1%～78% A；9.1～15 min，22% B、78% A；流速：0.3 mL/min；進樣量：5 μL；柱溫：40 ℃。

質譜條件：電噴霧離子源（electrospray ionization，ESI），正離子掃描，多反應監(jiān)測模式；毛細管電壓：4.0 kV；干燥氣溫度：350 ℃；干燥氣流速：10 L/min；霧化器壓力：35 psi；定性、定量離子對：m/z 335.1＞262.4、335.1＞291.4*（*為定量離子）；駐留時間：60 ms；碎裂電壓：70 V；碰撞能：19、15 eV。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2010軟件進行平均值及標準差計算；采用Microsoft Office Word 2010軟件繪制表格；采用OriginPro 8.5軟件作圖并進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析；電泳圖采用Quantity One分析軟件進行圖象采集、定量和分析。

2 結果與分析

2.1 抗AMOZ衍生物scFv基因構建和鑒定

圖1 重疊延伸擴增電泳鑒定（A）、陽性轉化子質粒PCR擴增 鑒定（B）和雙酶切鑒定（C） Fig. 1 Identification of SOE-PCR amplification of scFv (A), recombinant plasmid pET22b(+)-scFv by PCR (B) and double restriction enzyme digestion (C)

SOE-PCR擴增電泳鑒定結果和陽性轉化子質粒的雙酶切鑒定和PCR擴增鑒定結果如圖1所示。從圖1A可知，SOE-PCR擴增后得到堿基長度約為750 bp的scFv基因，與預期片段大小一致。從圖1B、C可知，陽性轉化子質粒經雙酶切和PCR擴增后，都得到了約750 bp大小的條帶，表明scFv基因已經成功克隆到pET22b（＋）表達載體上并轉化到大腸桿菌BL21（DE3）中。將PCR和雙酶切鑒定正確的陽性重組子質粒進行測序鑒定，得到的scFv基因序列如圖2所示。可以看出，抗AMOZ衍生物單克隆抗體的VH和VL基因大小分別為348 bp和321 bp，抗體VH和VL基因已由45 bp的linker連接在了一起，形成了正確的抗AMOZ衍生物scFv基因結構，沒有發(fā)生移碼現(xiàn)象。

圖2 抗AMOZ衍生物scFv基因全序列Fig. 2 Full length sequence of scFv against AMOZ derivative

2.2 抗AMOZ衍生物scFv表達、純化和活性鑒定

圖3 重組scFv蛋 白SDS-PAGE鑒定（A）和Western blotting分析（B）Fig. 3 Identifciation of the recombinant antibody by SDS-PAGE (A) and Western blotting (B)

從抗性平板上挑取抗AMOZ衍生物scFv陽性克隆菌的單菌落進行搖瓶培養(yǎng)，以pET22b（＋）載體的空菌作為對照，經0.6 mol/L IPTG 24 ℃誘導表達7 h后收集菌體，進行SDS-PAGE和Western blotting分析，結果見圖3。SDS-PAGE結果可知，陽性克隆菌在相對分子質量約為27 kDa時條帶明顯增粗，Western blotting分析結果可知，該蛋白能夠與抗His標簽單克隆抗體發(fā)生特異性結合，表明表達的蛋白就是目的scFv。本實驗發(fā)現(xiàn)抗AMOZ衍生物scFv蛋白在pET22b（＋）載體中是以包涵體形式表達的，誘導表達結束后采用溶菌酶和超聲波結合的方式裂解菌體制備抗AMOZ衍生物scFv包涵體，對包涵體進行洗滌、變性、Ni柱親和純化、復性與超濾濃縮處理，制備得到的抗體質量濃度為 1.2 mg/mL，純度約為97%。從圖4可知，該抗體能夠特異性識別AMOZA-OVA包被抗原，效價大約1∶640，NPAMOZ藥物對抗體有抑制作用，說明得到的重組scFv具有活性，可以用于下一步AMOZ殘留icELISA分析方法的建立。

圖4 AMOZ衍生物scFv效價測定和抑制作用分析Fig. 4 Titer and inhibition of scFv antibody against AMOZ derivative

2.3 基于scFv的AMOZ殘留icELISA檢測方法的建立

采用棋盤滴定實驗優(yōu)化AMOZA-OVA包被原包被質量濃度和scFv稀釋度，競爭抑制藥物NPAMOZ質量濃度為1 μg/mL，結果如表2所示。由表2可知，隨著包被質量濃度的降低，B0呈現(xiàn)逐漸降低的趨勢，隨著抗AMOZ衍生物scFv稀釋倍數(shù)的增大，B0下降較快。在競爭ELISA法中，B/B0越小，靈敏度越高，但是B0太大或太小也會增加誤差，從而降低方法的靈敏度。綜合考慮不同條件下的B0和B/B0值，選擇的包被抗原質量濃度和scFv稀釋倍數(shù)分別為0.062 5 μg/mL和20 倍。

在上述優(yōu)化的實驗條件下，建立基于scFv測定NPAMOZ的icELISA分析方法，標準曲線如圖5所示，采用OriginPro 8.5軟件進行四參數(shù)對數(shù)擬合計算，得到NPAMOZ icELISA檢測方法的半抑制濃度（IC50）為11.35 μg/L（相當于AMOZ 8.65 μg/L），檢測限（IC10）為1.94 μg/L（相當于AMOZ 1.48 μg/L）， 線性檢測范圍（IC20～IC80）為3.81～69.93 μg/L（相當于AMOZ 2.90～53.28 μg/L），線性回歸方程為 y＝-0.574 7x＋1.135 6（R2＝0.998 3）。

表2 棋盤滴定實驗Table 2 Results of chessboard titration

圖5 NPAMOZ的icELISA標準曲線（n=3）Fig. 5 Standard curve of icELISA for NPAMOZ (n = 3)

2.4 icELISA方法特異性分析

用交叉反應率評價icELISA方法的特異性，交叉反應率越低，特異性越好。交叉反應率計算公式如下：

選擇與NPAMOZ結構相似的其他硝基呋喃類抗生素及其代謝物對本實驗建立的icELISA方法進行特異性評價，由表3可知，本研究制備得到的抗AMOZ衍生物scFv特異性很好，除與原藥呋喃它酮有交叉反應（交叉反應率為63.98%）外，與其他硝基呋喃類抗生素及其代謝物交叉反應率均小于0.1%。

表3 NPAMOZ及其類似物與scFv的交叉反應Table 3 Cross-reactivity of NPAMOZ and its analogs with scFv antibody

續(xù)表3

2.5 AMOZ衍生條件的優(yōu)化

選擇2-NBA、3-NBA和4-NBA 3 種作為衍生劑，由圖6A可知，3 種硝基苯甲醛衍生劑的衍生效果相差不大，因為繪制標準曲線時用的競爭藥物為2-NPAMOZ，所以選擇2-NBA作為后續(xù)衍生條件優(yōu)化的衍生劑；加入2-NBA衍生劑25、50、100、200、250 μL，考察衍生試劑用量對衍生率的影響，由圖6B可知，隨著2-NBA用量的增加，衍生率逐漸增大，衍生劑用量超過100 μL時，衍生率相對穩(wěn)定，故衍生劑用量選擇100 μL；衍生溫度選擇30、40、50、60、70 ℃，考察衍生溫度對衍生率的影響，由圖6C可知，隨著衍生溫度的升高，衍生率逐漸提高，當衍生溫度達到60 ℃時，衍生產物生成量相對穩(wěn)定，所以選擇衍生溫度為60 ℃；衍生時間選擇1、2、4、6、8 h、過夜（傳統(tǒng)衍生過夜，約16 h），考察衍生時間對衍生率的影響，由圖6D可知，隨著衍生時間的延長，衍生率逐漸變大，衍生時間超過4 h后衍生率相對穩(wěn)定，從快速檢測方法的需求出發(fā)，衍生時間選擇4 h，和傳統(tǒng)的衍生過夜（約16 h）相比，可以大大縮短實驗時間，提高工作效率。綜上所述，優(yōu)化的AMOZ衍生條件為衍生劑2-NBA、用量100 μL、衍生溫度60 ℃、衍生時間4 h，在此優(yōu)化條件下測得的衍生率為88%，比優(yōu)化前有一定的提高（優(yōu)化前衍生率為79%左右）。

圖6 衍生試劑種類（A）、衍生試劑用量（B）、衍生溫度（C）和 衍生時間（D）對AMOZ衍生率的影響Fig. 6 Effects of the type of derivative reagent (A), the amount of derivatization reagent (B), temperature (C), and derivatization time (D) on the derivatization efficiency of AMOZ

2.6 添加回收實驗

icELISA方法的添加回收實驗測定結果采用HPLCMS/MS進行確證，2 種方法的添加回收率對比結果見表4。icELISA方法的平均回收率為74.3%～86.6%，相對標準偏差（relative standard deviation，RSD）為7.0%～12.6%。對2 種方法的檢測結果進行相關性分析，發(fā)現(xiàn)2 種方法相關性良好（R2＝0.999 2），說明本研究建立的icELISA方法能夠準確篩選出陽性樣品，可用于蝦類等水產樣品中AMOZ殘留的高通量免疫快速檢測。

表4 icELISA法和HPLC-MS/MS法陰性蝦肉樣品添加回收率的 比較（n ＝3）Table 4 Comparison of recoveries for spiked negative shrimp samples determined by icELISA and HPLC-MS/MS (n= 3)

3 結 論

本研究從分泌產生抗AMOZ衍生物單克隆抗體雜交瘤細胞中成功克隆獲得了抗體VH和VL基因，通過(G4S)3連接肽采用重疊延伸PCR技術成功構建scFv基因，以pET-22b（＋）為表達載體，大腸桿菌BL21（DE3）為表達系統(tǒng)，經IPTG誘導表達和Ni親和柱純化，得到的重組scFv，能夠特異性識別AMOZA-OVA包被抗原，NPAMOZ藥物對抗體有抑制作用，說明制備得到的重組scFv是特異性的抗AMOZ衍生物scFv。在此基礎上采用棋盤滴定實驗對AMOZA-OVA包被原包被濃度和scFv稀釋度進行優(yōu)化，建立了基于此scFv的AMOZ殘留icELISA方法并進行了評價，發(fā)現(xiàn)建立icELISA方法的檢測靈敏度、定量線性范圍、交叉反應率和添加回收率均達到相關檢測限量要求，方法準確可靠，可用于蝦類等實際樣品中AMOZ殘留免疫檢測。本研究不僅為AMOZ殘留免疫檢測提供了一種新的高特異性低成本的基因工程抗體，也為今后利用基因工程抗體開發(fā)AMOZ殘留免疫檢測商品化試劑盒提供參考依據(jù)，具有很好的應用前景。