側向免疫層析快速檢測牛乳中四環素和青霉素

吳玉晗，陳 偉

（合肥工業大學食品與生物工程學院，安徽 合肥 230009）

四環素是廣譜類抗生素，是一種從放線菌金色鏈叢菌培養液分離出來的抗菌物質[1]，因具有優良的廣譜抗菌性，預防和抗病能力強，被廣泛用于治療和預防動物疾病。但由于在奶牛養殖業中的不合理使用和濫用，造成四環素在牛乳中的殘留問題[2]。許多國家都規定了牛奶中四環素的殘留限量，歐盟及我國對四環素最大殘留限量的規定均為0.1 mg/kg[3]。青霉素是指化學結構中含有 β-內酰胺環的一類抗生素[4]，它由于能夠阻止細菌細胞壁的合成而呈現殺菌活性，常用于預防和控制各種細菌引起的動物的尿道、胃腸道和呼吸道感染，治療奶牛的乳腺炎[5]。青霉素G由于其廣譜、價格低廉而被大量甚至是超劑量的使用，導致牛乳中含有較高劑量的殘留物，進而通過食物鏈危害人體健康，人體長期攝入含有該抗生素殘留的食物易導致細菌耐藥性增加，過敏反應和體內菌群失調[6]等癥狀。

目前報道的食物中四環素和青霉素抗生素殘留的檢測方法主要有儀器分析法[7-9]、微生物測定法[10-11]和免疫分析法[12-13]。儀器分析法主要包括高效液相色譜法[14]、液相色譜-串聯質譜法[15]，其準確性高，但存在設備操作復雜、耗時時間長、對操作人員要求高、難以滿足現場快速檢測的需要。微生物法雖然檢測成本低，但靈敏度不高，容易出現假陽性結果。現常用的免疫分析法包括酶聯免疫檢測法[16]和放射免疫分析法[17]，具有快速、靈敏等特點，但兩者的前處理過程較為復雜，對于現場大規模篩查樣品有很大的局限性。

側向免疫層析技術是近幾年來發展比較迅速的制備檢測試紙條基本方法的快速檢測技術[18]，其以條狀纖維層析材料為固相，借助毛細管的吸附作用使樣品在層析材料上移動，樣品中的待測物與層析材料上一定區域的配體發生特異性的免疫結合反應，通過可目測標記物（如膠體金）的顯色反應短時間獲得直觀的測試結果，廣泛應用于臨床檢驗和食品檢測等領域[19-20]。膠體金免疫層析技術以膠體金為示蹤標記物，將膠體金標記技術、免疫檢測技術和層析分析技術等多種方法有機結合 起來[21]。其靈敏度高、對操作人員要求低，并且不需要昂貴的儀器設備，易于實現現場檢測，主要作為定性或半定量篩選檢測手段[22]。目前已有使用金標免疫層析法檢測牛乳中的β-內酰胺和四環素類抗生素，其最低檢測靈敏度僅可達到4 ng/mL和80 ng/mL[23]，其中四環素檢測的檢出限遠低于國家標準。近幾年也有很多關于使用膠體金免疫層析法單獨檢測四環素類抗生素的研究，但其檢測靈敏度都不是很高，比如檀尊社等[24]研制的膠體金免疫層析試劑，檢測的水產品中四環素含量，檢出限為100 ng/mL。本研究以膠體金側向免疫層析技術為基礎，加以改進，采用牛乳樣品與金標抗體提前孵育后上樣的方法，與傳統檢測方法相比靈敏度得到顯著提高，達到了增敏的效果。且牛乳樣品不需要前處理，操作簡單，大大提高了檢測效率，可實現快速同時檢測牛乳樣品中兩種抗生素的目的，適合現場快速篩查。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

牛乳 市購；氯金酸（分析純） 百靈威科技有限公司；檸檬酸三鈉、碳酸鉀（均為分析純）、牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA，純度＞98%） 國藥集團化學試劑有限公司；青霉素標準品（純度99.9%）、四環素標準品（化學純） 國家標準品物質中心；青霉素、四環素抗體和包被 天津生物科技有限公司；羊抗鼠二抗、吸水墊、樣品墊、PVC支撐底板和硝酸纖維素膜 上海捷寧生物有限公司。

1.2 儀器與設備

Heraeus Fresco 17高速冷凍離心機 美國賽默飛科技公司；AL104分析天平 上海精天電子儀器有限公司；EOS600D單反相機 佳能光學設備有限公司；XYZ-3試紙條噴膜儀、CM-4000試紙條切條機 美國Bio-Dot公司；RCT加熱磁力攪拌器 廣州儀科實驗室技術有限公司；移液器 芬蘭雷勃公司；DHG-9101-SA 恒溫干燥箱 上海三發科學儀器有限公司；微型旋渦混合儀 上海滬西分析儀器廠有限公司。

1.3 方法

1.3.1 膠體金的制備

采用檸檬酸三鈉還原法制備[25]。將50 mL雙蒸水倒入250 mL錐形瓶中，再滴加850 μL 5 mg/mL氯金酸溶液于雙蒸水中，置于磁力加熱攪拌器上加熱到微沸。當錐形瓶中液體微沸后，保持1 500 r/min的攪拌轉速不變，再迅速加入一定體積質量濃度為10 g/L的檸檬酸三鈉溶液。溶液顏色在2 min內發生明顯變化，透明-黑-紫-酒紅，至顏色不變后，關閉熱源，繼續攪拌5 min即可，冷卻，于4 ℃冰箱保存。

1.3.2 單克隆抗體-膠體金標記物的制備

取1 mL制備好的膠體金溶液，用0.1 mol/L碳酸鉀溶液，調至pH值約為7.2，再加入6 μL四環素抗體振蕩反應1 h后，再加入100 μL質量分數為10%的BSA溶液，繼續振蕩反應0.5 h，9 600 r/min離心10 min，產生紅色沉淀；10% BSA 100 μL復溶后即可得到四環素的金標抗體溶液，置4 ℃備用。按同樣的方法制備青霉素單克隆抗體-膠體金標記物。

1.3.3 膠體金雙重試紙條的組裝

試紙條由樣品墊、NC膜和吸水墊3 個部分組成。首先將寬度為22 mm玻璃纖維素膜在樣品墊預處理液中浸泡2 h后，取出于27 ℃條件下烘干待用。然后將羊抗鼠二抗、四環素-BSA和青霉素-BSA用10 mmol/L磷酸緩沖液（pH 7.4）稀釋至1 mg/mL，用噴膜儀依次噴至NC膜上，作為質控線和兩條檢測線，27 ℃烘干2 h后取出，最后將樣品墊、NC膜和吸水墊依次粘貼在塑料底板上，用切條機切割成3 mm寬的試紙條保存備用。

1.3.4 試紙條的檢測

1.3.4.1 偶聯過程中抗體添加量的優化

在膠體金與標記抗體偶聯過程中，加入不同添加量的抗體進行偶聯，確定最適宜的偶聯抗體條件。

1.3.4.2 偶聯過程中偶聯pH值的優化在膠體金與標記抗體偶聯過程中，加入不同添加量碳酸鉀溶液進行偶聯，確定最適宜的偶聯pH值條件。

1.3.5 靈敏度檢測

取四環素和青霉素標準品溶液，用pH 7.2、0.2 mol/L 的磷酸鹽緩沖液稀釋到不同質量濃度，不同質量濃度的混合溶液與金標偶聯物在孵育器上孵育10 min后，滴加到試紙條上進行測試，在孵育器上測試10 min后觀察試紙條顯線結果。

1.3.6 特異性檢測

將牛乳中常檢的其他抗生素、藥物和添加劑：克倫特羅、萊克多巴胺、沙丁胺醇、三聚氰胺、氯霉素用pH 7.2、0.2 mol/L的磷酸鹽緩沖液稀釋后用試紙條進行檢測，判斷試紙條的特異性。

1.3.7 添加回收實驗

向空白牛乳樣品中添加四環素和青霉素標準溶液，使其四環素和青霉素質量濃度分別均為0.05、1、 2 ng/mL，依照1.3.5節方法進行檢測，得到的結果計算加標回收率，再分別對每種檢測物的3 個質量濃度滴度平行測定8 次，計算相對標準偏差。

2 結果與分析

2.1 檢測原理

圖1 四環素和青霉素雙重檢測試紙條原理圖Fig. 1 Schematic diagram of the test strip used for detection of tetracycline and penicillin

圖1 為四環素和青霉素雙重檢測的原理圖。當C線、T1線和T2線均顯色，無論顏色深淺均表示牛乳樣品中兩種抗生素質量濃度低于檢出限；當C線和T2線顯色，T1線無顯色，表示牛乳樣品中四環素質量濃度等于或高于檢出限；當C線和T1線顯色，T2線無顯色，表示牛乳樣品中青霉素質量濃度等于或高于檢出限。

2.2 抗體量的優化

圖2 四環素（a）和青霉素（b）在不同抗體量下的試紙優化結果Fig. 2 Optimization of antibody dose

與金納米粒子偶聯的四環素與青霉素抗體量優化結果如圖2所示，向相同體積的金納米粒子溶液中加入不同體積1 mg/mL的四環素與青霉素抗體，可以明顯看出，隨著加入抗體體積的增大，陰性T線強度有明顯的提高，C線強度變化不明顯。四環素抗體量3 μL時陰性強度明顯強于1 μL時的抗體量，出于節約原料方面考慮，四環素選擇抗體量為3 μL；而青霉素隨著抗體量增加，陰性強度逐漸增強，青霉素抗體量選擇為5 μL。

2.3 偶聯pH值的優化

免疫層析試紙條制備過程中偶聯pH值的選擇對檢測靈敏度極為重要。用制備的試紙條對不同質量濃度的實際樣品進行檢測，結果如圖3所示，比較偶聯添加不同碳酸鉀量，可以看出，四環素在碳酸鉀添加量為5 μL時靈敏度較3 μL時高，陰性較7 μL時強，所以四環素的碳酸鉀添加量選擇5 μL；青霉素隨著碳酸鉀添加量的增加，陰性有減弱的趨勢，而靈敏度并沒有因此增加，因此青霉素偶聯碳酸鉀量選擇2 μL。

圖3 四環素（a）和青霉素（b）在不同偶聯pH值下的試紙優化結果Fig. 3 Optimization of pH for coupling reaction

2.4 四環素和青霉素的單重檢測結果

制作好的免疫膠體金試紙條于肉眼下觀察，10 min即可出現結果。分別對四環素和青霉素利用雙重試紙條進行靈敏度檢測，由圖4a、b可得，在只有四環素或者青霉素獨立存在的情況下，隨著四環素和青霉素質量濃度的增大，檢測線的顯線強度不斷減弱，且四環素和青霉素靈敏度分別達到1 ng/mL和2 ng/mL。再根據顯色結果對T1、T2線作出峰形圖，結果如圖4c、d所示，在只有四環素存在的情況下，T1線信號強度峰值隨著四環素質量濃度增高而不斷降低，T2峰值穩定；在只有青霉素存在的情況下，T2線信號強度峰值隨著青霉素濃度增高而不斷降低，T1峰值穩定，表明四環素和青霉素互相之間不存在交叉反應現象。

圖4 四環素（a、c）和青霉素（b、d）的單重檢測結果Fig. 4 Results of separate detection of tetracycline and penicillin

2.5 四環素和青霉素的雙重檢測結果

同時對四環素和青霉素進行靈敏度檢測，即將二者的標準品溶液稀釋不同質量濃度后混合上樣，10 min后觀察結果如圖5a所示，隨著四環素和青霉素質量濃度的增大，兩條T線顏色均逐漸減弱，且檢出限皆可達到 2 ng/mL。再根據顯色結果對C、T線作出峰形圖以及根據峰形圖得出的線性圖，結果如圖5b所示，T1和T2的峰高均隨著兩種抗生素質量濃度的增大而逐漸減弱。結果表明，在0～2 ng/mL的四環素和青霉素質量濃度范圍內，根據試紙檢測結果T線強度峰面積和四環素與青霉素同時檢測質量濃度關系繪制標準曲線，所建立的免疫膠體金檢測方法對四環素和青霉素的同時檢測具有良好的線性關系，其線性回歸方程分別為Y1＝435-1 612X（＝0.995 6）和Y2＝252-1 086X（＝0.989 3）。

圖5 四環素和青霉素的雙重檢測結果Fig. 5 Results of simultaneous detection of tetracycline and penicillin

2.6 特異性驗證結果

圖6 四環素和青霉素的特異性檢測結果Fig. 6 Specificity evaluation of the test strip for detection of tetracycline and penicillin

如圖6所示，選取另外幾種牛乳中常檢的抗生素和添加劑：克倫特羅、萊克多巴胺、沙丁胺醇、三聚氰胺、氯霉素、鏈霉素。6 種小分子及四環素和青霉素的檢測質量濃度均為1 μg/mL。如圖6a所示，四環素和青霉素結果的T線完全消失，四環素的T1線消失，青霉素的T2線消失，其余6 種小分子的檢測結果相同，即3 條線同時存在，說明質量濃度為1 μg/mL的6 種小分子均不能使試紙檢測達到消線水平，同時對顯線結果做出了峰形 （圖6b），都說明此方法的特異性很強。

2.7 添加回收實驗結果

將四環素和青霉素標準品溶液加入空白牛乳樣品中，使其四環素和青霉素質量濃度分別均為0.05、1、2 ng/mL，每個滴度設8 個重復，樣品準備好后，用免疫層析試紙條進行檢測，并用Image J掃描其結果得到T線灰度值，根據標準曲線計算四環素和青霉素含量及其回收率。如表1所示，四環素回收率在98.6%～100.2%之間，青霉素回收率在97.1%～101.3%之間。

表1 牛乳樣品中四環素和青霉素的添加回收實驗Table 1 Recoveries of tetracycline and penicillin spiked in milk samples

3 結 論

膠體金側向免疫層析技術是以膠體金作為示蹤標記物應用于抗原抗體反應的一種新型的免疫標記技術[26]，由于其高效、簡便、快速的性能，在現場篩查中得以廣泛應用。多元檢測是膠體金免疫層析法發展的趨勢，它能同時高效檢測目標物，降低檢測成本[27]。本實驗基于膠體金側向免疫層析方法，建立能同時檢測牛乳中殘留的四環素和青霉素的方法，結果表明本實驗研制的試紙條能達到聯檢的目的，特異性較高。此外該方法舍棄了使用金標墊的傳統型試紙條檢測方法，利用預孵育的高效性，與傳統檢測方法相比，既保留了檢測樣品無需預處理、檢測快速等優點，又顯著提高了檢測靈敏度[28]。在最優化條件下增敏型試紙條對四環素和青霉素的檢出限為2 ng/mL，檢測時間10 min，檢測特異性好，同時也適用牛乳樣品中四環素和青霉素殘留檢測。

本研究成功建立了四環素和青霉素的雙重免疫層析試紙條檢測方法，研制的試紙條對四環素和青霉素具有很高的特異性和敏感性。驗證實驗證明，該試紙條使用方便、快捷且操作簡單，在對大量食品樣本現場篩檢方面具有重要的應用價值，為我國現有食品檢測技術提供了重要參考[29-30]。