結直腸癌中HSF1、c-Jun與DPD表達的相關性及其臨床意義

劉 柳，吳淑華，李揚揚，許曉陽，何 雙，溫菲菲，郭寧杰，賈真真

結直腸癌是常見的消化道惡性腫瘤，目前以氟尿嘧啶為重要組份的聯合化療方案依然是臨床診療指南推薦的中晚期結直腸癌患者的一線治療方案[1]。有研究顯示，在結直腸癌的臨床治療中，5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil, 5-FU)在抗腫瘤及明顯提高患者生存時間的同時也產生了嚴重的耐藥與毒副作用，甚至導致化療過程的延遲與中斷[2-5]。隨著對腫瘤耐藥機制的深入分析，對5-FU起關鍵代謝作用的二氫嘧啶脫氫酶(dihydropyrimidine dehydrogenase, DPD)引起學者的關注[6-7]，調控DPD的表達可能成為逆轉5-FU耐藥的新思路。轉錄因子在蛋白質啟動轉錄過程中發揮重要作用。新近研究發現，熱休克轉錄因子1(heat shock factor 1, HSF1)是一組結構和功能具有廣泛同源性，并且普遍存在于真核生物細胞中的轉錄因子，HSF1不僅可啟動熱休克蛋白家族基因的轉錄，同時也可啟動非熱休克蛋白家族基因的轉錄。本實驗采用免疫組化、Western blot和qRT-PCR法檢測結直腸癌中HSF1、c-Jun、p-c-Jun與DPD的表達，分析其相關性，探討四者與臨床病理特征的關系及臨床意義，為逆轉臨床5-FU耐藥提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1組織標本 收集2013年1月～2014年12月濱州醫學院附屬醫院病理科存檔的具有完整隨訪資料的結直腸癌標本。納入標準根據WHO(2019)消化系統腫瘤分類進行，由兩位資深病理醫師采用雙盲法重新閱片診斷為原發性結直腸癌。所有病例均為首次手術治療，術前均未行任何放、化療，術后應用FOLFOX方案化療。本實驗收集結直腸癌138例，其中男性77例，女性61例；年齡32～89歲，平均67歲；腫瘤直徑<5 cm者58例，≥5 cm者80例；組織類型：管狀腺癌95例，管狀-黏液腺癌14例，黏液腺癌29例；分化程度：高分化19例，中分化83例，低分化36例；浸潤深度：累及黏膜及黏膜下層11例，侵犯肌層48例，侵及或浸透外膜者79例；有淋巴結轉移者67例，無淋巴結轉移者71例。每年進行電話或門診隨訪，隨訪截至2019年12月或患者死亡，失訪者不予入組。

1.1.2新鮮標本 收集2018年1～12月濱州醫學院附屬醫院病理科接收新鮮的結直腸癌標本16例，取癌旁正常腸黏膜組織作對照，所有組織一部分即時液氮凍存，一部分置入10%中性福爾馬林中固定。

1.1.3試劑 兔抗人HSF1(ab61382)、c-Jun(ab31419)、p-c-Jun(ab30620，Ser63磷酸化位點)及DPD(ab134922)抗體，均購自Abcam公司；羊抗兔/鼠Ⅱ抗(ab5878)購自福州邁新公司，免疫組化試劑盒購自北京中杉金橋公司。Western blot實驗所需試劑購自上海碧云天公司。qRT-PCR實驗中RNAiso、RT試劑盒及PCR試劑盒，均購自Takara公司；特異性引物序列由Takara公司合成。

1.2 方法

1.2.1免疫組化 采用免疫組化EnVision法染色：將切片脫蠟至水，高壓熱修復抗原，3%H2O2去除內源性過氧化物酶，加一抗HSF1(1 ∶450)、c-Jun(1 ∶150)、p-c-Jun(1 ∶200)及DPD(1 ∶300)抗體4 ℃過夜，PBS水洗后加二抗37 ℃孵育30 min，DAB顯色，蘇木精復染，1%鹽酸乙醇分化，脫水透明，中性樹膠封固。用已知HSF1蛋白陽性的正常睪丸組織、c-Jun及p-c-Jun蛋白陽性的乳腺癌組織、DPD蛋白陽性的肝癌組織作為陽性對照，用PBS代替一抗作為陰性對照。

1.2.2Western blot法 冰上提取組織蛋白，經BCA法蛋白定量后上樣，SDS-PAGE電泳分離蛋白質，轉膜并封閉，一抗HSF1(1 ∶5 000)、c-Jun(1 ∶1 000)、p-c-Jun(1 ∶1 000)及DPD(1 ∶2 000)4 ℃過夜，TBST洗去一抗后二抗(羊抗兔IgG，1 ∶1 000)孵育2 h，ECL曝光，用Quantity One軟件分析目的蛋白和GAPDH的吸光度值，以目的蛋白與GAPDH吸光度值的比值作為目的蛋白相對表達量。

1.2.3qRT-PCR檢測 按照Trizol試劑盒說明書提取組織RNA并檢測其濃度，在37 ℃ 15 min、85 ℃ 5 s條件下將RNA逆轉錄成cDNA。PCR反應采用SYBR Green相對定量PCR法，按照試劑盒說明書配置25 μL體系反應液，在CFX96T RT-PCR Detection System C1000上進行擴增(表1)。反應條件：95 ℃ 30 s GOTO 39(合計40個循環)，95 ℃ 5 s、60 ℃ 30 s。采用ΔΔCt法檢測，樣品相對表達量用2-ΔΔCt表示，ΔΔCt=結直腸癌ΔCt-正常結直腸黏膜組織ΔCt，ΔCt=目的基因Ct值-GAPDH Ct值。實驗重復3次，結果取其平均值。

表1 qRT-PCR引物序列

1.3 結果判讀

1.3.1HSF1、c-Jun、p-c-Jun判讀標準 三種蛋白主要表達于細胞核，以呈棕黃色為陽性，在低倍鏡下觀察10個獨立視野，選取5個陽性細胞數最多的視野，根據陽性細胞染色強度和陽性細胞百分率進行判斷。(1)按陽性細胞染色強度計分：無著色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分；(2)按陽性細胞百分率計分：≤5%為0分，6%～25%為1分，26%～50%為2分，51%～75%為3分，>75%為4分。將兩項評分結果相乘作為最終結果，≥4分為陽性，<4分為陰性。

1.3.2DPD判讀標準 DPD主要表達于胞膜或胞質，在低倍鏡下觀察10個獨立視野，選取5個陽性細胞數最多的視野，采用Image Pro 6.0軟件進行半定量分析，檢測視野陽性區域的積分光密度(IOD)值，取其平均值。統計所有視野的IOD值，總平均值為127.52±4.11，低于總平均值的判讀為陰性，高于總平均值則為陽性。

1.4 統計學分析采用SPSS 23.0軟件進行統計學分析。組間比較及蛋白表達與臨床病理參數的相關性采用χ2檢驗；蛋白表達的相關性用Spearman相關性分析；生存分析采用Kaplan-Meier法，并以Log-rank法檢驗；采用Cox比例風險回歸模型進行多因素生存分析。以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 結直腸癌與正常黏膜中HSF1、c-Jun、p-c-Jun及DPD的表達免疫組化檢測結果顯示：HSF1、c-Jun、p-c-Jun主要表達于細胞核中，DPD主要表達于細胞質中，其在結直腸癌組織中的陽性率分別為62.3%、71.0%、52.9%、67.4%，均高于正常黏膜組織(P<0.05，表2，圖1)。Western blot結果顯示：HSF1、c-Jun、p-c-Jun及DPD在結直腸癌組織中的表達均高于正常結直腸黏膜組織，差異有統計學意義(P<0.05，圖2)。qRT-PCR檢測結果顯示：HSF1、c-Jun及DPD在結直腸癌組織中的相對表達量高于正常黏膜組織，其差異有統計學意義(P<0.05，圖3)。

圖1 A.HSF1在正常結直腸黏膜組織中呈陰性，EnVision法；B.HSF1在結直腸癌中呈陽性，EnVision法；C.c-Jun在正常結直腸黏膜中呈陰性，EnVision法；D.c-Jun在結直腸癌中呈陽性，EnVision法；E.p-c-Jun在正常結直腸黏膜組織中呈陰性，EnVision法；F.p-c-Jun在結直腸癌中呈陽性，EnVision法；G.DPD在正常黏膜組織中呈陰性，EnVision法；H.DPD在結直腸癌組織中呈陽性，EnVision法

圖2 Western blot法檢測HSF1、c-Jun、p-c-Jun及DPD在結直腸癌和正常黏膜組織中的表達：A.電泳圖；B.直方圖，N.正常結直腸黏膜組織，T.結直腸癌組織

圖3 qRT-PCR檢測HSF1、c-Jun及DPD mRNA在結直腸癌和正常黏膜組織中的表達

表2 結直腸癌和正常黏膜組織中HSF1、c-Jun、p-c-Jun及DPD的表達[n(%)]

2.2 結直腸癌中DPD蛋白表達與c-Jun、p-c-Jun、HSF1表達的相關性根據DPD的免疫組化染色結果，將138例結直腸癌組織分為DPD陽性組和DPD陰性組，分析HSF1、c-Jun、p-c-Jun與DPD蛋白表達的相關性。組間比較顯示：DPD陽性組中HSF1、p-c-Jun的表達均高于陰性組，差異有顯著性(P<0.05)；而c-Jun的表達差異無統計學意義(P>0.05)。χ2檢驗結果顯示：結直腸癌中DPD與p-c-Jun、HSF1的表達均呈正相關(P<0.05)；DPD與c-Jun蛋白表達無相關性(P>0.05，表3)；HSF1與p-c-Jun的表達無相關性(P>0.05，表4)。

表3 結直腸癌中DPD與c-Jun、p-c-Jun及HSF1表達的相關性

表4 結直腸癌中HSF1與p-c-Jun表達的相關性

2.3 HSF1與p-c-Jun不同分組中DPD蛋白的表達根據HSF1與p-c-Jun的免疫組化表達將其分為4個亞組，分別為HSF1+/p-c-Jun+、HSF1+/p-c-Jun-、HSF1-/p-c-Jun+、HSF1-/p-c-Jun-。本實驗采用免疫組化及Western blot法檢測不同分組中DPD蛋白表達，并進行組間兩兩比較，分析組間DPD表達的差異性。本組結果顯示，HSF1+/p-c-Jun+組中DPD陽性率高于其他三組，而HSF1-/p-c-Jun-組中DPD的表達低于其他三組，差異有統計學意義(P<0.01)，在HSF1+/p-c-Jun-組中DPD的表達則高于HSF1-/p-c-Jun+組，組間比較差異有統計學意義(P<0.05，表5，圖4)。

表5 HSF1與p-c-Jun不同分組中DPD蛋白的表達[n(%)]

圖4 Western blot法檢測HSF1和p-c-Jun不同分組中DPD蛋白表達：A.電泳圖；B.直方圖

2.4 結直腸癌中c-Jun、p-c-Jun、HSF1及DPD的表達與臨床病理特征的相關性結直腸癌中HSF1蛋白表達與浸潤深度及淋巴結轉移密切相關(P<0.05)；p-c-Jun蛋白表達與分化程度具有相關性(P<0.05，表6)。DPD蛋白表達與組織學類型及浸潤深度密切相關，DPD在黏液腺癌及伴黏液腺癌成分的管狀腺癌中的表達高于管狀腺癌，差異均有統計學意義(P<0.05，表6)。

表6 結直腸癌中c-Jun、p-c-Jun、HSF1及DPD的表達與臨床病理特征的相關性

2.5 生存分析138例結直腸癌患者中位生存時間為65.2個月，平均5年生存率為63.4%。Kaplan-Meier分析顯示HSF1、DPD及淋巴結轉移與結直腸癌患者預后密切相關(P<0.05)。HSF1、DPD陽性患者的5年生存率分別為23.3%和29.0%，低于HSF1、DPD陰性患者的5年生存率(78.8%、75.6%)；HSF1與p-c-Jun均陰性患者的預后較好，其5年生存率為85.2%，而HSF1、p-c-Jun均陽性患者的5年生存率為20.8%，兩組比較差異有統計學意義(P<0.05，圖5)。Cox回歸模型分析顯示HSF1、DPD及淋巴結轉移是結直腸癌預后的獨立危險因素(P<0.05，表7)。

圖5 結直腸癌患者預后生存曲線：A.HSF1預后生存曲線；B.DPD預后生存曲線；C.HSF1和p-c-Jun不同分組預后生存曲線；D.淋巴結轉移預后生存曲線

表7 結直腸癌患者預后Cox多因素生存分析

3 討論

目前，結直腸癌的治療以手術切除為主，對于術后和失去手術機會的結直腸癌患者，化療依然是治療的重要手段。目前，5-FU依然是Ⅲ期結直腸癌和部分具有高危因素結直腸癌患者的標準治療方案。由此可見，控制5-FU的代謝狀態及藥代動力學對于確保臨床療效具有重要意義。參與5-FU代謝的酶主要有DPD、TS、TP等[8-9]，其中DPD作為5-FU代謝的起始和限速酶在眾多5-FU代謝酶中倍受關注。DPD是由2個相同亞基與相對分子質量為10.5×104的分子組成的高二聚體酶，主要分布在肝臟、外周血單核細胞，炎性組織及正常組織中也有適量分布。DPD作為5-FU代謝的關鍵酶，其表達上調可加速5-FU在肝臟中的分解代謝，減少腫瘤藥物濃度，從而降低抗癌效果[10-11]。文獻報道，口腔癌、尿路上皮癌等多種腫瘤中均存在DPD異常表達，其表達增高可降低腫瘤細胞對5-FU的反應度，反之腫瘤組織對5-FU的敏感性提高[12-13]。有研究顯示，結直腸癌中DPD高表達可降低5-FU的化療敏感性，應用DPD抑制劑可提高5-FU的治療效果[14-15]。本實驗結果顯示，結直腸癌中DPD mRNA及蛋白表達水平均高于正常結直腸常黏膜組，與其他學者的研究結果一致。本實驗結果同時顯示，DPD與患者的生存密切相關，并且在黏液腺癌中高表達。作者認為，結直腸癌中存在DPD的轉錄或轉錄后水平異常，導致其蛋白升高，影響腫瘤對5-FU的敏感性，產生化療抵抗，在一定程度上影響臨床療效及患者預后。由此可見，深入分析結直腸癌中DPD的轉錄、表達變化規律及其調控機制，對臨床個性化治療具有重要意義，可成為逆轉耐藥的新思路。

DPD是由定位于染色體1p21-1p22區域的二氫嘧啶脫氫酶基因(dihydropyrimidine dehydrogenase gene, DPYD)編碼，包括23個外顯子，轉錄為含1 025個氨基酸的蛋白。研究表明，c-Jun、c-Fos、PU.1等多種轉錄因子均可參與DPYD啟動轉錄為DPD的過程[16]。Ukon等[17]在HSC42和293T細胞中發現，由轉錄因子c-Jun參與組成的激活蛋白-1(activator protein-1, AP-1)在啟動DPYD轉錄翻譯中發揮重要作用，激活AP-1可啟動DPYD的轉錄。其主要通過高度保守的堿性亮氨酸拉鏈(bZIP)形成同源或異源二聚體，與DNA結合參與多種生長因子和細胞因子的基因轉錄，從而調控腫瘤細胞的增殖、分化、轉化、侵襲和耐藥等過程。然而，在結直腸癌中關于轉錄因子與DPD的關系以及與臨床藥物療效及預后的相關性尚缺乏深入分析。本實驗結果顯示，結直腸癌DPD陽性組中p-c-Jun表達高于DPD陰性組，而c-Jun表達差異無統計學意義；提示p-c-Jun有可能參與結直腸癌中DPYD的啟動轉錄，增加DPD的表達。本實驗結果顯示，DPD與p-c-Jun的表達并不完全同步，在一部分DPD陽性病例中p-c-Jun呈陰性，這與以往其他報道不同。我們推測c-Jun對DPD的啟動轉錄并非全部，可能有更多的轉錄因子參與其中。因此，進一步揭示DPD的轉錄機制，對于提高結直腸癌患者的療效具有重要臨床意義。新近研究發現，由c-Jun參與組成的AP-1蛋白不僅可通過bZIP蛋白形成同源或異源二聚體，還可與非bZIP蛋白以特定序列與其特定基因的啟動子結合，如核轉錄因子NF-κB[18]、CREB結合蛋白[19]和HSF1[20]等，從而擴大AP-1家族蛋白的組合多樣性和調控的基因范圍，進而發揮激活或抑制作用。

HSF是一類能與HSE結合并調節細胞內熱休克蛋白表達的反式細胞因子，可在外界刺激或病理狀態下被激活，繼而誘導熱休克蛋白的表達。本課題組前期研究表明[20]，HSF1在結直腸癌組織中高表達，HSF1不僅可啟動熱休克蛋白基因家族的轉錄，同時也可啟動非熱休克蛋白的轉錄，如多藥耐藥基因MDR1的轉錄。Sawai等[21]研究發現，c-Jun、c-Fos啟動子中均存在熱休克反應元件HSE。在HaLe細胞中，經熱刺激激活的HSF1可與c-Jun中的HSE結合，啟動c-Jun轉錄翻譯。Ciato等[22]在Cushing病的研究中發現，HSF1在抑制劑KRIBB11參與下通過與c-Jun、c-Fos啟動子中的熱休克反應元件HSE結合，抑制POMC啟動轉錄，從而減少促腎上腺皮質激素ACTH分泌。然而，在結直腸癌中有關HSF1與c-Jun的關系鮮見報道。本實驗結果顯示，當結直腸癌中HSF1、p-c-Jun同時陽性時，DPD陽性率顯著高于其他組；當HSF1、p-c-Jun同時陰性時，DPD陽性率顯著低于其他組，且HSF1陽性組DPD的表達高于p-c-Jun陽性組；提示HSF1、p-c-Jun均與DPD的表達有關，且HSF1有可能直接調控DPD的表達。我們推測作為重要的轉錄因子HSF1可以與任何存在熱休克反應元件的基因結合，啟動其轉錄過程。由于c-Jun啟動子中存在熱休克反應元件，兩者可能以AP-1家族蛋白組合的形式啟動DPD轉錄，促進其高表達。HSF1對DPD的影響是否通過DPYD上的熱休克反應元件來完成，還需進一步分析。

影響結直腸癌患者預后的因素眾多[23-24]，本實驗對HSF1、p-c-Jun、DPD的表達與結直腸癌臨床病理特征的相關性進行分析，結果顯示：HSF1蛋白表達水平與浸潤深度及淋巴結轉移密切相關；p-c-Jun蛋白表達水平與分化程度有相關性；DPD蛋白表達水平與組織學類型及浸潤深度密切相關。Kaplan-Meier分析表明，HSF1、DPD及淋巴結轉移均與結直腸癌患者預后密切相關。Cox多因素生存分析顯示，HSF1、DPD及淋巴結轉移是結直腸癌預后的獨立危險因素。我們推測作為生物學功能廣泛的轉錄因子，HSF1與c-Jun可以同源或異源聚體的形式，啟動多種基因的轉錄過程，不僅參與腫瘤發生、發展，并且在5-FU起始和限速酶DPD的啟動與轉錄過程中發揮重要作用，從而影響了結直腸癌的生物學行為以及5-FU的療效。

綜上所述，HSF1、c-Jun、p-c-Jun、DPD在結直腸癌中高表達，HSF1可能通過與磷酸化修飾的轉錄因子p-c-Jun結合，形成新的異源二聚體進而啟動DPYD轉錄和翻譯，也可能自身以同源聚體形式啟動DPD的轉錄，導致結直腸癌中DPD升高，引起5-FU的耐藥。HSF1、p-c-Jun、DPD表達分別與腫瘤分化程度、淋巴結轉移等多種臨床病理特征及預后密切相關，對結直腸癌化療方案的選擇以及判斷腫瘤預后的個體差異均具有重要意義。然而，本實驗僅對HSF1、c-Jun、p-c-Jun和DPD蛋白表達的相關性及其臨床意義進行初步探討，還需增加樣本量進一步分析，并深入開展分子機制的分析，為臨床個性化用藥的選擇及逆轉結直腸癌耐藥提供可靠依據。