食管上皮性病變真菌檢測的臨床價值

陳 玉，周 強

消化系統腫瘤是人類常見的疾病之一，隨著工業化進程和人們生活水平的提高及飲食結構的改變，其整體發病率呈年輕化且有上升趨勢，但其病變特點、發生和發展機制尚不清楚[1]。食管癌是常見的消化系統惡性腫瘤，病死率高，可分為鱗狀細胞癌及腺癌兩種病理類型，我國約90%食管癌患者為食管鱗狀細胞癌，其發生是一個多因素、多步驟的生物學過程。目前，食管癌的主要病因有遺傳易感因素、化學類亞硝胺物質、缺乏某些微量元素、煙酒、熱食、熱飲、口腔不潔以及生物性病因，如真菌感染，其中真菌是主要因素。目前，真菌在食管上皮性病變中的檢出率報道較少，六胺銀染色主要對組織中的真菌著色。本文采用HE和六銨銀染色檢測食管病變組織中真菌的陽性率，探討真菌檢測在食管上皮性病變中的臨床價值。

1 材料與方法

1.1 臨床資料收集2018年9月～2019年3月南京大學醫學院附屬鼓樓醫院病理科食管鱗狀上皮性病變125例，其中低度上皮內瘤變30例、高度上皮內瘤變30例、鱗狀細胞癌35例、慢性食管炎伴鱗狀上皮增生30例?；颊吣行?4例，女性51例，年齡40～74歲，平均(58.3±4.8)歲。本實驗經我院倫理委員會批準，患者均知情同意。

1.2 方法(1)HE染色：每個病例選取1張白片進行HE染色，使用DAKO全自動染色機染色；顯微鏡高倍視野觀察有無真菌。(2)六銨銀染色：每個病例選取1張黏附載玻片撈片的白片，60 ℃烘箱，烤片30 min，二甲苯脫蠟3次，無水乙醇脫二甲苯3次，流水沖洗數秒，置入鉻酸氧化10 min，胺銀染液70 ℃浸染60 min，鏡下觀察染色程度至標本轉變成黃褐色，流水沖洗數秒，0.1%氯化金調色1～2 min，流水沖洗數秒，伊紅復染10 s，流水沖洗，DAKO全自動染色機選擇封片程序封固。鏡下1 000倍視野觀察。

1.3 統計學分析采用SPSS 20.0軟件進行統計學分析，計數資料采用χ2檢驗，以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 不同染色方法在食管上皮性病變的真菌檢出率HE染色在慢性食管炎伴鱗狀上皮增生和低度上皮內瘤變真菌檢出率均為0(圖1)，在高度上皮內瘤變和鱗狀細胞癌中的檢出率較高分別為6.7%和14.3%(圖2、3)。六銨銀染色法在慢性食管炎伴鱗狀上皮增生中為0，在低度上皮內瘤變中為30%(圖4)，高度上皮內瘤變的檢出率為33.3%(圖5)，鱗狀細胞癌中檢出率60%(圖6)。在高度上皮內瘤變及鱗狀細胞癌中，HE及六銨銀染色在診斷真菌檢出率差異有統計學意義(χ2=6.67，P<0.05；χ2=17.35，P<0.05，表1)。

圖1 食管低度上皮內瘤變未見真菌附著，HE染色 圖2 食管高度上皮內瘤變見真菌附著，HE染色 圖3 食管鱗狀細胞癌見真菌附著，HE染色 圖4 食管低度上皮內瘤變表面未見真菌附著，表面脫落的正常上皮碎片可能在六銨銀染色下誤診為真菌，六銨銀染色 圖5 食管高度上皮內瘤變表面見真菌附著，六銨銀染色 圖6 食管鱗狀細胞癌表面見真菌附著，六銨銀染色

表1 不同染色在食管上皮性病變中的真菌檢出率

2.2 HE聯合六銨銀染色在食管上皮性病變中的真菌檢出率HE聯合六銨銀染色在不同食管上皮性病變中真菌檢出率不同，在慢性食管炎伴鱗狀上皮增生和低度上皮內瘤變中的檢出率為0和16.7%，在高度上皮內瘤變和鱗狀細胞癌中的檢出率為36.7%和57.1%，隨著食管上皮性病變惡性程度增生，真菌檢出率有提高，差異有統計學意義(χ2=35.95，P<0.05，表1)。

3 討論

目前，上消化道腫瘤與微生物菌群的分析還處于起步階段，多項流行病學研究均提示上消化道腫瘤與微生物菌群密切相關[2-4]。癌前病變的特征性菌群可為腫瘤的早診斷、早治療提供新的理論依據，具有潛在的應用前景。識別上消化道癌的標志性菌群不僅可以通過改變菌群組成來治療疾病，也可用于腫瘤預后復發評估及預警，進一步探討微生物菌群在腫瘤發生、發展中的作用及機制，是上消化道腫瘤預防領域的研究方向[5]。

組織中真菌檢測采用HE染色一般著色不佳，只有當真菌數量較多時HE染色法才可鑒別。六銨銀染色可用于組織切片中真菌的檢測，與HE和PAS染色相比，其更適合真菌感染檢測，特別是在僅有少量有機體的情況下。本實驗在鱗狀細胞癌中單純采用HE染色辨別真菌陽性率僅有14.3%，聯合六銨銀進行判斷陽性率提升至57.1%，表明六銨銀染色在真菌的診斷及鑒別診斷具有重要意義。

本組中不同級別的食管上皮性病變中，真菌的檢出率隨著疾病組織學類型的改變而逐漸升高，提示真菌在不同階段食管上皮性病變的發生、發展中可能發揮重要作用。我國對食管癌高發區研究表明，癌前病變或早期食管癌患者的食管上皮中存在真菌感染，其中念珠菌屬真菌是最常見的真菌類型[6]。Hsia等[7]報道白色念珠菌能夠增強食道特異性致癌物芐基甲基亞硝胺-亞硝酸鹽形成，從而誘導腫瘤發生。以上證據表明，真菌在食管癌發生中發揮重要作用，并成為腫瘤微環境研究熱點。食管癌中真菌檢出率增強可能與腫瘤局部免疫微環境受到破壞、菌群失調引起真菌定植相關，但有關真菌在食管腫瘤發生及影響腫瘤微環境中的菌體作用研究尚缺乏，需要進一步分析。

特殊染色是病理診斷的輔助技術，雖然沒有免疫組化的敏感性和特異性高，但對某些疾病的病理診斷發揮重要作用。現階段特殊染色試劑盒和全自動儀器還未普及，特殊染色操作多由手工完成，試劑也多需自配，導致結果穩定性較差。因此在特殊染色操作中，應采用外部陽性對照，尤其是六銨銀和抗酸染色，以防漏診。另外，六銨銀染色雖然在日常診斷中敏感性高，但特異性低，在真菌檢出方面可能與正常雜菌或脫落的上皮碎片混淆，仍需聯合HE進一步診斷。在病理技術方面，HE及免疫組化染色均通過全自動化設備(如全自動HE染色機及全自動免疫組化染色機)實現標準化操作，成為病理質量控制的可靠工具，為病理實驗室的國際標準化發展接軌也起重要作用，因此特殊染色的全自動操作是病理技術發展的必然趨勢。如果能采用全自動特殊染色技術，可為檢測結果的準確性進一步提供保證，使病理技術操作具有規范化和穩定性[8]。

綜上所述，采用不同染色方法在食管上皮性病變中真菌檢出陽性率不同，其與食管上皮性病變級別增加相關，六銨銀聯合HE染色對食管真菌的檢出準確率的提高具有重要意義。