腺病毒介導的p53消減基因對慢性低氧性肺動脈高壓大鼠的影響

張鳳玉，俞霽云，陳明星，王 軍，丁昌平，蔡逸婷*

(1.上海市第一人民醫院檢驗科，上海 200080；2.上海藝星整形美容醫院整形外科，上海 200030；3.揚州大學附屬醫院中心實驗室，江蘇 揚州 225001)

肺動脈高壓(pulmonary artery hypertension，PAH)是由多種病因引起的慢性致死性疾病，常見的病因主要有：肺部疾病或缺氧誘發的PAH；由左心衰引起的PAH；慢性血栓栓塞性PAH；具有不明確或多種病因的PAH；肺靜脈閉塞性疾病或肺毛細血管血管瘤誘導的PAH[1]。低氧性PAH是臨床上最常見的病理生理過程，也是慢性阻塞性肺疾病、慢性肺心病和高原PAH等心肺疾病發生發展的關鍵環節[2]。當下對PAH的治療熱點多集中在分子和基因水平上[3]，筆者通過持續通入N2使氧含量維持在10%左右，慢性低氧培養誘導大鼠低氧性PAH模型，用重組腺病毒載體介導的p53消減基因轉染低氧性PAH模型的大鼠，旨在探索低氧性PAH大鼠模型的建立方法，觀察p53對低氧性PAH大鼠肺動脈壓力和細胞凋亡的影響，為低氧性PAH的研究提供實驗動物模型及新的理論依據。

1 材料與方法

1.1實驗動物 SD大鼠60只，雄性，體重180～200 g，7周齡，SPF級，購自上海斯萊克公司，SCXK(滬)2017-0005，合格證號20170005004525。飼養條件：溫度范圍20～25 ℃，相對濕度范圍40%～70%，自由飲食。實驗前在動物房環境中適應一周，實驗過程中對動物的處置符合揚州大學動物倫理學標準。

1.2實驗材料 重組腺病毒質粒Adeno-null,Adeno-p53由廣州賽業生物科技有限公司構建, TurboFect Transfection reagent(R0531)購自Thermo Scientific公司，293A細胞購自長沙贏潤生物技術有限公司，TUNEL細胞凋亡檢測試劑盒(11684817910)購自Roche公司，蛋白酶K(RT403-01)購自天根生物有限公司，蘇木素(H9627)購自Sigma公司，氯化鈉注射液購自河北天成藥業股份有限公司。低氧艙：ZKY-4F氧濃度監測儀，小動物呼吸機(HX-101E)、生物機能實驗系統(BL-420S)購自成都泰盟軟件有限公司。

1.3低氧性PAH模型的建立 將SD大鼠隨機分為常氧對照組、常氧實驗Adeno-null組、常氧實驗Adeno-p53組、低氧對照組、低氧實驗Adeno-null組和低氧實驗Adeno-p53組各10只，常氧組為正常氧濃度培養，低氧組則置于常壓低氧箱內，氧濃度維持在(10±0.5)%，8 h/d，連續4周。每天觀察并記錄大鼠外觀體征、行為活動等。

1.4重組腺病毒的Adeno-p53的制備 3條構建好的pAV-p53載體質粒和空白對照組腺病毒載體質粒分別與轉染試劑室溫混合后，轉染293A細胞，反復擴增，空斑實驗法測定轉染液病毒滴度。Quantitative-PCR法測得重組腺病毒Adeno-p53和空白對照組的滴度分別為3.2×1010pfu/mL和1.0×1010pfu/mL。使用前，用無菌的生理鹽水將腺病毒Adeno-null與Adeno-p53稀釋至3×108pfu/mL。

1.5重組腺病毒的轉染 4組大鼠喂養2周后，采用氣管滴入法轉染重組腺病毒，大鼠用戊巴比妥鈉45 mg/kg麻醉，剃毛消毒，經口-氣管插管行機械通氣，同時鈍性分離頸部肌肉暴露氣管，在會厭軟骨下方氣管里滴入30 μL腺病毒，浸潤一段時間后。將大鼠頭朝上直立，使病毒均勻分布于各肺葉。所有滴入腺病毒后的大鼠置于恒溫墊上，統一右側臥位，等待自然蘇醒。滴入腺病毒12 h后分別放入低氧艙和正常培養環境中，繼續飼養2周。

1.6平均頸總動脈壓及平均肺動脈壓測定 動物飼養4周后，巴比妥鈉45 mg/kg麻醉后連接呼吸機，分離頸總動脈，結扎遠心端，動脈夾固定近心端。插管后利用生物機能實驗系統監測大鼠頸總動脈壓，待穩定后連續監測5～10 min。分離頸總動脈后，游離右側頸外靜脈，將導管自右頸外靜脈內慢慢插入，待壓力波形穩定后，實時記錄肺動脈壓。

1.7右心室肥厚指數(right ventricular hypertrophy index,RVHI) 右心導管測壓后處死大鼠，快速取出心臟，分離右心室和左心室加室間隔，分別稱量右心室(right ventricular，RV)和左心室+室間隔[(left ventricle,LV)+(interventricular septum,S)]的重量，以RV/(LV+S)作為RVHI。依據RVHI評估右心室質量變化，判定有無右心室肥厚。

1.8細胞凋亡TUNEL染色 取左肺用4%甲醛固定，乙醇梯度脫水，二甲苯透明，石蠟包埋后切片。石蠟切片常規脫蠟至蒸餾水水化，PBS沖洗。Proteinase K工作液37 ℃消化20 min，PBS沖洗。每片加5 μL TDT+45 μL 熒光素標記的dUTP混合液，37 ℃反應1 h，PBS沖洗。每片加50 μL converter-POD，37 ℃作用30 min，PBS沖洗。加適量DAB底物，顯微鏡下控制顯色，蘇木素復染數秒，水洗后脫水，透明，封片后鏡下拍照，隨機采集5個不重復視野，計數凋亡細胞。凋亡指數(apoptosis index，AI)=動脈平滑肌細胞凋亡數目/平滑肌細胞數目。

1.9統計學方法 應用GraphPad prism 6.0統計軟件分析數據。計量資料比較采用兩獨立樣本的t檢驗。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1實驗動物一般情況觀察 造模過程中正常氧培養組狀態良好，行為活潑，毛發光潤，飲食排便正常，無死亡出現。低氧培養組從活躍狀態轉入睡眠、安靜、少動狀態，食物飲水減少，體重降低，精神狀態低迷，病死率20%。病毒滴入實驗不會干擾常氧組大鼠的行為特征和活動。

2.2低氧性PAH模型的鑒定 常壓下持續通入10.0% O2培養4周的大鼠與正常情況下培養的大鼠相比，平均肺動脈壓力顯著升高，右心室明顯肥厚，差異有統計學意義(P<0.01或P<0.05)，平均頸總動脈壓差異無統計學意義(P>0.05)。提示低氧培養可以成功建立大鼠的低氧性PAH模型。見表1。

表1 低氧對照組與常氧對照組大鼠平均頸總動脈壓、平均肺動脈壓及RVHI的比較

2.3Adeno-p53轉染對大鼠頸總動脈壓及肺動脈壓的影響 低氧培養條件下，與低氧實驗Adeno-null組相比，低氧實驗Adeno-p53組肺動脈壓和RVHI降低，差異有統計學意義(P<0.05)，頸總動脈壓力差異無統計學意義(P>0.05)。提示p53消減可明顯減低低氧性PAH的肺動脈壓力。見表2。

表2 低氧條件下Adeno-P53轉染對大鼠頸總動脈壓及肺動脈壓及RVHI的影響

2.4Adeno-p53轉染后檢測各組大鼠肺動脈平滑肌細胞的凋亡情況 低氧實驗Adeno-p53組的肺動脈平滑肌細胞的凋亡指數顯著高于低氧實驗Adeno-null組及低氧對照組，低氧實驗Adeno-null組和低氧實驗Adeno-p53組細胞凋亡指數高于常氧對照組，常氧實驗Adeno-null組和常氧實驗Adeno-p53組大鼠肺動脈平滑肌細胞的凋亡指數高于常氧對照組大鼠，差異有統計學意義(P<0.05)。提示p53消減會促進大鼠肺動脈平滑肌細胞的凋亡，同時亦增加低氧性PAH模型中肺動脈平滑肌細胞的凋亡。見表3，4，圖1。

表3 常氧Adeno-null組與常氧實驗Adeno-p53組凋亡細胞數比較

表4 低氧Adeno-null組與低氧實驗Adeno-p53組凋亡細胞數比較

3 討 論

低氧性PAH影響因素眾多，且大部分相互交錯形成復雜的網絡關系。臨床上PAH患者肺動脈平滑肌細胞增殖增多，凋亡降低，大多由平滑肌細胞的固有特征和外源性調控平滑肌細胞生長的各種基因的異常表達所致[4-5]。目前國內外的研究多集中在低氧動物模型，側重分析各種因子的變化、血管再生和重塑、動脈狹窄、低氧誘導、細胞增殖等。本研究利用持續通入N2控制O2濃度為10%左右，模擬低氧環境，隨之將大鼠置于其中28 d，復制大鼠的低氧性PAH模型，檢測發現低氧條件下大鼠平均肺動脈壓比常氧條件明顯增加，同時低氧組大鼠右心室肥厚指數明顯增高，表明低氧性PAH模型建立成功。慢性低氧是PAH形成的重要因素之一，根據最新的PAH分類指南[6]，高原PAH是PAH分類的第3類，而低氧性PAH模型是高原PAH研究的首選模型，該模型制作簡便，重復性高，模型中大鼠存活率高，同時接近臨床PAH發病的自然病理過程，并且可以模擬臨床上一般PAH患者的病理特征[7]。該模型的成功建立及其與臨床PAH病理生理過程的相似性，為臨床上研究低氧性PAH發病機制和新型靶向藥物提供理論依據和實驗基礎。

p53是近年研究最為廣泛和深入的腫瘤抑制基因之一，可以促進腫瘤細胞凋亡。p53是一種位于細胞核的多效性轉錄因子，可參與細胞內眾多的生理和病理過程[8-9]，包括細胞增殖、凋亡、分化、血管生成、生長因子信號傳導等調節[10-11]。也有研究表明p53是低氧誘導凋亡的關鍵因子[12-14]。研究顯示p53基因會隨著低氧時間增加而在低氧性PAH大鼠肺組織中的表達逐漸增加(尤其是平滑肌細胞)，且大鼠肺組織肺動脈平滑肌細胞異常增殖增加，管壁增厚，管腔狹窄，p53基因增加會促進肺動脈平滑肌細胞異常增殖，因而可以推測p53消減后，肺動脈平滑肌細胞細胞增殖減少，凋亡增加[15]。另有研究顯示在PAH中表達增加的p53基因會失去下調抗凋亡基因Bcl-2的作用，使Bcl-2表達增加[16]。筆者利用p53消減腺病毒轉染低氧性PAH后的大鼠，其平均肺動脈壓力較低氧性PAH組大鼠明顯降低，p53消減干擾后的低氧組大鼠的右心室肥厚指數與低氧對照組對比也顯著降低，同時肺動脈平滑肌細胞的凋亡指數明顯高于PAH模型對照組。由此推斷，消減p53基因的表達可促進肺血管平滑肌細胞的凋亡，而低氧環境下促凋亡基因和促增殖基因的表達失衡是目前公認的導致肺動脈平滑肌細胞增殖的原因之一。PAH的發生發展及其嚴重程度與肺動脈平滑肌細胞凋亡密切相關，誘導凋亡可以減輕PAH的發病程度[14]。p53基因在特定條件下具有決定細胞命運的重要作用，研究證實低氧時肺動脈平滑肌細胞中p53等促凋亡基因減少，此過程參與低氧時肺血管壁的重建和慢性PAH的形成[17-19]。慢性低氧性PAH模型中，血管平滑肌增殖活性升高的同時，細胞凋亡也有所增強，其生理意義在于試圖從整體上維持平滑肌細胞數目的動態平衡。而血管平滑肌細胞凋亡增加是為了對抗其增殖增強，是防止血管壁過度增厚的保護性反應。凋亡降低可能與p53的表達增高有關，p53可以緩解肺動脈平滑肌細胞增殖和凋亡的失衡狀態，在一定程度上延緩PAH的進展。