一種新西蘭兔頸椎椎間融合模型的建立及評價

陳 松，索世琪，李成立，張 飛，李佳奇，張 為*

(1.河北工程大學附屬醫院脊柱外科，河北 邯鄲 056002；2.河北醫科大學第三醫院脊柱外科，河北 石家莊 050051)

頸椎前路椎間盤切除融合術(anterior cervical discectomy and fusion,ACDF)是目前治療頸椎退行性疾病最常用的手術方法之一。目前對于脊柱融合動物模型的研究多以胸腰椎為主。頸椎椎間融合動物模型多見于大型動物，但大型動物圍手術期管理復雜，因場地及經費原因飼養大量的大型動物進行研究是困難的。而小型動物又因椎體及附件過小不便于固定，術后X線難以觀察。目前國內外研究缺乏成功的能很好模擬臨床頸椎椎間植骨融合后狀態的小型動物模型。本研究通過測量兔頸椎骨性結構的數據，在此基礎上應用鋼板螺釘系統進行兔頸椎椎體間植骨融合內固定，并通過大體觀察、手觸檢查、X線檢查、微型計算機斷層掃描(micro computed tomography,Micro-CT)等檢查驗證該模型的可行性及安全性，為頸椎融合相關基礎研究提供一種可靠的動物模型。

1 材料與方法

1.1實驗動物 選用體重2.0～2.5 kg的健康雄性新西蘭白兔36只(河北醫科大學第三醫院實驗動物中心提供)，隨機分為A、B、C、D 4組，每組9只。A組用于解剖測量兔頸椎椎體結構；B組(造模4周組)、C組(造模8周組)、D組(造模12周組)行頸椎椎間植骨融合內固定。醫學實驗動物生產許可證編號SCXK(冀)2016-002；合格證編號181104。所有動物飼養條件相同，分籠飼養。本研究遵守動物倫理學要求，并經倫理委員會批準。

1.2動物模型制作

1.2.1術前準備 測量觀察兔頸椎解剖結構并定制合適的鋼板螺釘(天津正天醫療器械有限公司,批號1800052159)，手術器械常規高壓消毒。術前6 h禁食水，稱重并記錄，配制麻藥。

1.2.2麻醉方法 采用20%烏拉坦(BOSF，W001)按3.5 mL/kg的劑量經耳緣靜脈注射進行全身麻醉。

1.2.3手術過程 麻醉成功后，兔側臥位于手術臺上，術區常規備皮、消毒、鋪巾。取髂嵴處切口，長約2 cm，逐層暴露髂骨外板，鈍性分離周圍軟組織，取約3 mm×4 mm大小髂骨塊備用，創面止血處理，待骨面無滲血后逐層縫合包扎。取仰臥位將兔固定于手術臺上，術區常規備皮、消毒、鋪巾，在顯微鏡輔助下行頸椎椎間植骨融合內固定術。取頸前正中偏右切口，長約4 cm，由頸動脈鞘與氣管、食管鞘間隙鈍性分離至椎體前，C臂定位C2/3椎體間隙，注意保護血管神經。仔細剝離頸長肌及前縱韌帶，在自制骨膜剝離子的輔助下顯露C2/3椎體間隙及上下椎體，用自制鉸刀去除C2/3椎間盤和終板，并在其輔助下將備用的髂骨塊植入C2/3椎體間隙。于上椎體的近下終板和下椎體近上終板處放置頸椎鋼板，使用鉆孔器鉆孔并置入螺釘。其他椎體操作同上。術區采用生理鹽水反復沖洗止血后逐層縫合包扎，造模完成。

1.3術后處理 術后分籠飼養，觀察其精神狀態、雙下肢運動、切口情況及營養狀況。切口處常規換藥并連續3 d給予青霉素5萬U肌肉注射。

1.4觀察手術并發癥發生情況 并發癥包括死亡、食管損傷、神經血管損傷、硬膜囊撕裂、術后切口感染、血腫形成、內固定斷裂移位、髂骨供區感染及脊髓損傷等。

1.5評價方法

1.5.1大體觀察 觀察實驗動物術后進食、活動量及對外界刺激的反應。

1.5.2影像學檢查 B、C、D組分別于術后4，8，12 周麻醉后行頸椎正側位X線檢查，觀察鋼板及螺釘位置以及是否存在內固定脫落、松動及椎間融合等情況。取出兔融合節段頸椎標本，剝離周圍的肌肉及軟組織，保留骨性結構部分后在18 μm分辨率下對各組標本進行Micro-CT檢查，以評估新骨生成及脊柱融合情況。使用分析軟件測定B、C、D組新生骨體積與植入材料總體積的比值(bone volume/total volume,BV/TV)。采用雙盲法由2名未參加實驗的醫生進行讀片，觀察頸椎椎間植骨融合情況，根據有無骨形成或融合進行評分，見表1。

表1 放射學評分系統

1.5.3手觸檢查 X線檢查完畢后采用空氣栓塞法處死B、C、D組實驗動物，取出兔融合節段頸椎標本進行手觸檢查。去除頸椎軟組織及前路鋼板、螺釘，采用雙盲法由2名未參加實驗的醫生對標本進行屈伸、側彎及扭轉來檢測融合節段的活動度，并且根據有無活動進行評分。無活動：融合;有活動：未融合。

1.6統計學方法 應用SPSS 22.0統計軟件分析數據。計量資料比較采用單因素方差分析和SNK-q檢驗。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1兔頸椎解剖結構及鋼板螺釘規格 兔頸椎椎體呈細腰鼓狀，椎體兩端粗大，中間稍細，椎體前面有骨嵴隆起，兩側為平整的斜面，測量頸椎椎體近終板處矢狀徑、橫徑、斜徑(骨嵴最高點旁開1 mm與矢狀徑呈45 °)及椎體長度(圖1)。自頸2(C2)～頸6(C6)椎體長度、椎體下端矢狀徑逐漸減小，差異有統計學意義(P<0.01)，C2～C6椎體下端橫徑差異無統計學意義(P>0.05)，C2～C6椎體下端斜徑變化波動，差異有統計學意義(P<0.01)。見表2。根據兔子椎體解剖結構，選用螺釘和鋼板的規格分別為1.7 mm×4 mm和4 mm×11 mm,在兔椎體的側前方進行鋼板固定，螺釘斜向后上方與椎體斜徑平行，避免進入椎管損傷脊髓,置入鋼板時，根據術中情況可適當調整(圖2)。

表2 兔頸椎骨性結構測量數據

2.2術后并發癥 術中因麻藥過量死亡3只,B組1只,C組0只,D組2只;術后感染死亡1只,C組1只；C組術后出現雙下肢癱瘓1只，可能因術中損傷脊髓有關，雖加強護理清潔并給與藥物治療，但最終因絕食而死亡。所有死亡動物均及時補齊。

2.3大體觀察 實驗動物術后當天飲食、活動及對外界刺激反應差，術后第1天對外界刺激反應可，飲食和活動稍差。術后第2天飲食、活動及對外界刺激反應基本恢復正常。

2.4影像學觀察 B、C、D組分別于術后4，8，12 周麻醉后行頸椎正側位X線檢查(圖3A～C)，B組植骨及鋼板位置良好，可見明顯間隙，其中1例出現螺釘松動退釘，其余無內固定斷裂、移位等情況。C組和D組植骨及內固定位置良好，無內固定松動、斷裂情況。C組椎間隙已模糊，可見骨痂生長；D組椎間隙已與上下椎體骨性連接。Micro-CT結果顯示B組可見椎間有骨痂形成，但仍可見明顯間隙;C組見椎間骨痂大量生長，間隙模糊;D組見椎間有連續骨性連接，無明顯間隙，已達到臨床融合效果。C組BV/TV和X線評分高于B組，D組BV/TV和X線評分高于B組和C組，差異有統計學意義(P<0.01)。見表3。

表3 BV/TV和X線評分比較

2.5手觸檢查結果 手觸摸檢查，B組椎間融合2例，融合率為22.2%(2/9);C組椎間融合5例，融合率為55.6%(5/9);D組椎間融合8例，融合率為88.9%(8/9)。

3 討 論

ACDF目前已成為治療退行性頸椎間盤病變的金標準。自體骨具有骨誘導、骨傳導、無免疫排斥反應、安全性高等特點，目前自體骨移植仍是骨移植的“金標準”[1-3]。自體骨作為椎間融合植骨材料在臨床上應用廣泛[4-5]。但自體骨移植存在一系列問題，如來源有限、術后供區疼痛等。另外，由于骨量的限制及松質骨含量較少，不適合大范圍的骨移植。人工植骨替代材料可彌補自體骨移植骨量不足的缺點、減少并發癥，近年來已逐漸成為研究熱點[6-8]。為了研究不同植骨材料或方式對脊柱融合的影響，研究者設計了一系列脊柱融合實驗動物模型[9-15]。然而，山羊、犬、豬等大型動物常因受到經濟和規模上的限制，導致研究結果不可避免會產生偏倚，影響其可靠性。而大鼠頸椎椎體及附件過小不便于固定，術后X線也難以觀察其融合程度。兔的脊柱解剖結構與人具有一定相似性，其為爬行動物，軸向應力與人在直立狀態下不盡相同，盡管兩者植骨融合過程存在一定的差異，但是因其價格低廉，耐受性較強，術后進食、抗感染等也相對容易控制，已廣泛用于研究脊柱融合[16]。目前兔脊柱融合模型多為腰椎后外側橫突間植骨融合。但該模型無法真實模擬目前臨床上應用較多的融合方式即椎間融合。兔頸椎椎間植骨融合模型目前報道較少，本研究根據兔頸椎的解剖特點，設計出一種能真實模擬頸椎ACDF手術路徑和融合方式的頸椎植骨融合模型的制作方法。本研究選取2～2.5 kg健康雄性新西蘭大白兔9只進行頸椎椎體解剖測量，根據兔頸椎解剖數據，確定鋼板及螺釘規格及置入位置。為了保證置入鋼板及螺釘的安全性及穩定性，在兔頸椎側前方進行鋼板固定。相較于側方固定，側前方固定可避免因術野暴露過大、術中失血過多而致動物死亡。另外，此處較為平整，更利于鋼板與椎體貼附、固定。術后X線檢查見植骨及鋼板位置均良好。置入螺釘的位置選擇椎體下端距離終板約2 mm處，此處椎體矢狀徑、橫徑、斜徑較大，沿斜徑方向置入螺釘，根據所測頸椎解剖數據，可避免螺釘進入椎管損傷脊髓。本研究結果顯示，B、C、D3組均未發生因螺釘進入椎管內挫傷脊髓致術后癱瘓，僅B組術后發生螺釘松動退釘1例，表明螺釘置入的方法安全可靠。

本研究采用烏拉坦進行麻醉，早期因麻藥過量致實驗動物死亡3只，隨著對麻藥劑量的調整和技術的提高，中后期未發生此類情況。盡管烏拉坦對實驗動物細胞膜、心血管活動、血液流變學、血糖以及癌基因有明顯影響，但其價格便宜、容易配制、麻醉效果穩定、維持時間長、對呼吸與循環抑制力弱、肌肉松弛好等優點，廣泛用于實驗動物麻醉。因此采用20%烏拉坦按3.5 mL/kg劑量經耳緣靜脈緩慢注射進行全身麻醉是安全可靠的。在麻醉時，須精確測量體重，根據體重計算給藥劑量，耳緣靜脈注射麻藥時須遵循先快后慢，勻速推進的原則。先快速推入總藥量的1/3，剩下的2/3緩慢勻速推入，給藥過程中須密切觀察兔子的狀態。術后感染死亡1只，可能與術中不慎污染手術器械有關。術后出現雙下肢癱瘓1只，分析原因可能是椎間盤摘除植骨融合過程中損傷脊髓所致。兔頸椎椎間隙自前下略斜向后上，有一定角度，摘除椎間盤和去除終板時須提高注意、動作輕柔，沿椎間隙方向進行，避免因不當操作損傷脊髓致使實驗動物術后肢體癱瘓或死亡。摘除間盤后去除終板直至滲血，給予充足骨量植骨以及維持椎間穩定是椎間融合的關鍵。本研究采用自體髂骨作為骨移植材料并采用Micro-CT評估新骨生成及脊柱融合情況。Micro-CT在骨代謝領域應用最為廣泛，是評價骨形態和骨微結構的計算機體層成像系統。Micro-CT具有高分辨率、使用方便等特點，可以獲得檢測骨組織內部三維結構信息，在小動物標本和大型動物離體標本的研究領域扮演著重要的角色。Micro-CT檢測BV/TV能夠反映不同樣本骨小梁的骨量，BV/TV值增高說明骨合成代謝大于分解代謝，骨量增加。BV/TV結果說明在骨量增加方面D組優于B組和C組，C組優于B組(P<0.01)。結合X線、Micro-CT和手觸檢查，結果表明隨著時間的推進，椎間融合程度及新生骨量方面日漸增加。

綜上所述，兔頸椎椎間植骨內融合固定動物模型設計合理、容易操作、費用低廉、與臨床上椎間融合相符，可為頸椎椎間融合的基礎研究提供了一種可靠的動物模型。(本文圖見封三)