CSFV與PRRSV檢測方法的建立及應用

錢 坤

（天津市農業生態環境監測與農產品質量檢測中心，天津 300402）

通過多重PCR技術進行CSFV與PRRSV檢測分析，可以有效的確診其具體的類型，分析其是否為單一性或者混合型的病毒類型。多重PCR技術在養殖行業中應用可以有效的滿足臨床大批量的檢測要求，效果顯著。

1 CSFV與PRRSV檢測方法的建立

豬繁殖障礙性疾病是一種危害養豬場的嚴重疾病，給生豬養殖造成了嚴重的經濟損失。此種疾病具有一定的傳染性。而豬瘟病毒（CSFV）、豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）兩種病毒的臨床癥狀較為類似，近些年存在多種病毒綜合感染的問題，單純的通過臨床癥狀無法確診。傳統的技術手段檢測周期長，在實驗室以及進行臨床上的大批量檢測中無法滿足實際的檢測要求。

多重PCR技術也稱之為多重引物PCR以及符合PCR技術手段，是通過在相同的PCR反應系統中添加兩對及以上的引物，通過同時進行擴增處理產生多個基因片段PCR反應的方式進行檢驗，是現階段在醫學領域中常見的分子生物學檢測手段。

此種方式檢測靈敏性較高，具有節省材料、經費的優勢，可以通過一次反應檢測多個病院，適合多種病原體的緩和性感染檢測，具有快速診斷的優勢。通過PCR機械進行處理，可以同時檢測三種病毒，此種方式在臨床中應用效果顯著。

2 CSFV與PRRSV檢測方法的應用

2.1 方法

2.1.1 引物設計與合成。根據三種病毒標準參考毒株基因序列進行選擇，選擇保守基因，進行特異性引物設計，通過稀釋，在-20℃環境中保存備用。

2.1.2 提取DNA以及RNA。通過對病豬組織樣品研磨處理，加入適當的生理鹽水進行搖勻，放在-20℃的環境中反復的凍融三次；將其放在8000rpm/min中進行3min的離心處理，獲得上清液，將其放在1.5ml的滅菌離心管之中，根據要求進行操作，檢測合格之后放在-20℃環境保存備用。

2.1.3 RNA病毒模板植被。選擇提取好的病毒，根據反轉錄實際說明書進行三種病毒的處理，檢測合格之后將其放在-20℃的環境中進行保存。

2.1.4 單項PCR檢測方法建立。根據引物濃度，在退火溫度條件之后通過反復的試驗分析確定最佳的單項PCR最佳反應條件。

2.1.5 多重PCR檢測方法建立。基于三種病毒的單項PCR反應為基礎，優化PCR的各項條件。

2.1.6 PCR擴增條件優化。通過將提取DNA以及c DNA為主要模板，分別在50℃、52℃以及54℃、58℃、60℃溫度狀態中，根據標準要求進行擴增處理，達到優化退火溫度參數的目的，確定其最佳的退火溫度。

2.1.7 多重PCR靈敏性試驗。過混合3種病毒核酸，通過ddH 20進行10倍稀釋處理，通過模板進行PCR分析。

2.1.8 多重PCR特異性試驗。通過優化操作體系、實驗程序進行處理，通過三種病毒的混合物作為模板，將陽性與陰性進行對照分析，進行多重PCR進行處理。

2.1.9 重復性試驗。構建多重PCR，通過反應體系以及程序進行重復性的檢驗，分析結果是否可靠。

2.2 結果

2.2.1 PCR擴增。通過單項、多重擴增檢查，通過分析可以確定3對PCR擴增的目的條帶大小符合預期，陰性對照并沒有擴增出條帶。

2.2.2 多重PCR退火溫度優化。通過選擇50℃、52℃以及54℃、56℃、58℃以及60℃的退火溫度，進行多重PCR分析，根據結果確定在退火溫度不同狀態之下對最終的擴增結果并不會產生較大的影響。通過分析確定將54℃作為最佳的多重PCR退火溫度。

2.2.3 靈敏性檢驗結果。通過優化處理的條件進行擴增10倍稀釋的CSFV獲得其最低檢測量的結果為39.3pg；PRRSV 55.1 pg的c DNA和DNA混合液最低檢測量分別為39.3pg、1.32pg.

2.2.4 特異性檢驗結果。根據已經優化的多重PCR反應體系進行特異性實驗分析，通過結果可以發現其并沒有擴增出條帶，而CSFV、PRRSV混合模板則存在清晰的條帶，其屬于目的片段，表明PCR特異性特征良好。

2.2.5 重復性實驗結果。構建多重PCR分析，了解不同時間段不同陽性樣品參數信息，重復檢測3次之后如果結果相同則表明多重PCR較為穩定。

2.2.6 多重PCR臨床樣品檢測結果。分析母豬組織樣品，根據操作進行多重PCR的檢測分析，其結果如表1：

通過分析可以確定多重PCR檢測結果與單一的RT-PCR檢測結果相同。

3 結束語

多重PCR檢測方法檢測效果顯著，具有敏感性高、重復性良好的特點。通過多重PCR方式進行檢測分析，可以檢測兩種病毒單一狀態或者混合感染。通過免疫組織化學方法進行處理，在檢測中通過進行免疫組織的化學染色方式，結果精準可靠，可以有效檢測兩種病毒。