冠狀病毒生物學特性、基因組結構及其誘導的免疫應答研究進展

汪婷，項前，金培培，盧文斌，林省偉，郭品豪，卞金俊

海軍軍醫大學長海醫院，上海200433

2019年12月中國武漢出現的新型冠狀病毒導致病毒性肺炎爆發，截至2月10日，全國累計報告新型冠狀病毒感染的肺炎確診37 626例，死亡1 016例，已引起全球極大關注。在新冠狀病毒基因組序列公布后，2020年2月12日國際病毒分類委員會(ICTV)將新病毒命名為嚴重急性呼吸綜合征冠狀病毒2(SARS-CoV-2)，世界衛生組織(WHO)將這一病毒導致的疾病命名為COVID-19，國內簡稱新冠肺炎。冠狀病毒與宿主免疫系統間的相互作用是病毒感染的基本發病機制，而機體的免疫應答對于控制和消除冠狀病毒感染至關重要?，F有關于SARS-CoV-2的研究基本以新病毒的生物學特性、基因結構、流行病學、臨床特征為主，涉及其免疫反應的研究較少，這與之前嚴重急性呼吸綜合征(SARS)以及中東呼吸綜合征(MERS)的文獻發表規律是一致的。SARS-CoV-2與SARS-CoV具有遺傳相似性，因此，SARS-CoV、MERS-CoV相關的免疫應答也是研究SARS-CoV-2免疫應答的基礎。本文將冠狀病毒的生物學特性、基因組結構及其誘導的免疫應答研究進展綜述如下。

1 冠狀病毒的生物學特性

冠狀病毒具有廣泛的自然宿主，是嚴重危害人類和動物健康的病原體，在基因型上分為四個屬，即α、β、γ和δ冠狀病毒。α和β冠狀病毒可以感染人類及哺乳動物，而γ和δ冠狀病毒一般感染鳥類和魚類。目前已知2個α冠狀病毒(HCoV-229E、HCoV-NL63)和4個β冠狀病毒(HCoV-OC43、HCoV-HKU1、SARS-CoV、MERS-CoV)可以感染人類，其中HCoV-229E、HCoV-OC43、HCoV-NL63和HCoV-HKU1僅誘發輕度上呼吸道疾病，在極少數情況下可引起嚴重感染。感染SARS-CoV和MERS-CoV后，患者在早期可能無癥狀，而潛伏期后可出現致命的下呼吸道感染和肺外表現，如肝損傷、腎功能不全。與SARS-CoV相似，感染SARS-CoV-2的患者主要臨床表現為發燒、咳嗽、胸痛、腹瀉等，重癥患者出現繼發感染、心臟損傷甚至死亡[1]。序列分析表明，SARS-CoV-2具有典型的冠狀病毒基因組結構，屬于β冠狀病毒。而基于冠狀病毒的系統樹分析表明，SARS-CoV-2與bat-SL-CoV ZC45、bat-SL-CoV ZXC21更相似，同一性達88%；據此推測，SARS-CoV-2的自然宿主也可能是蝙蝠，但在從蝙蝠到人的傳染過程中很可能存在未知的中間宿主[2]。

2 冠狀病毒的基因組結構

冠狀病毒是直徑為120～160 nm的球形顆粒，其基因組為長26～32 kb的單股正鏈RNA，是已知RNA病毒中基因組最大的病毒。與細胞mRNA類似，冠狀病毒包含5′帽端和3′poly(A)尾端。近5′端三分之二的基因組包含兩個重疊的開放閱讀框(ORF)，即ORF1a和ORF1b。ORF1a翻譯產生多蛋白1a(pp1a)，核糖體移碼使ORF1b翻譯產生pp1ab。這些多蛋白編碼16種非結構蛋白(NSP)，其中大多數參與病毒基因組復制。近3′端三分之一的基因組編碼一系列結構蛋白，即棘突蛋白(spike S)、包膜蛋白(envelope E)、膜蛋白(membrane M)、核衣殼蛋白(nucleocapsid N)。此外，不同的冠狀病毒還編碼特殊的輔助蛋白，如3a/b蛋白、4a/b蛋白。最近研究發現，SARS-CoV-2的基因組編碼8種輔助蛋白，即3a、3b、p6、7a、7b、8b、9b和orf14[3]。這些輔助蛋白分子量低、表達少，不參與構建冠狀病毒的基本結構。結構蛋白為了適應環境的變化而具有變異性，相比之下，非結構蛋白更保守[4]。

3 冠狀病毒誘導的免疫應答

3.1 先天性免疫應答

3.1.1 介導干擾素(IFN)應答 冠狀病毒感染時，哺乳動物的先天性免疫系統是第一道重要防線，其中Ⅰ型IFN是宿主抗病毒的主要效應因子，可限制病毒傳播、促進巨噬細胞吞噬抗原及自然殺傷細胞(NK)清除受感染細胞和T/B細胞[5]。因此，阻斷IFN產生可以直接促進冠狀病毒在宿主中的存活。病毒侵入宿主后，模式識別受體(PRR)最先識別冠狀病毒核酸，募集特定的銜接蛋白以激活干擾素調節因子3(IRF-3)和IRF-7，并促進機體合成Ⅰ型IFN。然后，Ⅰ型IFN激活下游JAK/STAT信號通路，促進干擾素刺激基因(ISG)表達，最終抑制病毒的復制和組裝。此外，編碼IFN的基因受NF-κB的調控，NF-κB在感測病毒核酸的信號轉導途徑中具有至關重要的作用。NF-κB的激活是一把雙刃劍，NF-κB正常情況下可以介導適當的先天性和適應性免疫反應，但其功能失調可導致炎癥性疾病及腫瘤發生[6]。NF-κB與 IκB(NF-κB的阻遏蛋白)結合，被錨定在細胞質中；IκB受到病毒刺激后被磷酸化，解除與NF-κB結合，NF-κB被釋放進入細胞核，從而促進相關的抗病毒基因表達。

IRF-3是IFN-β、干擾素刺激基因56(ISG56)、干擾素γ誘導蛋白10(IP-10)和其他抗病毒基因的關鍵轉錄因子。在未感染冠狀病毒的細胞中，IRF-3 位于細胞質中，并處于非活性狀態。感染冠狀病毒后，IRF-3被磷酸化和二聚化，之后進入細胞核并上調IFN-α和IFN-β基因轉錄，同時募集轉錄共激活因子cAMP-反應元件結合蛋白(CREB)，從而啟動IFN-β mRNA合成。IFN-β合成增加，與其細胞表面的受體結合，促進與抗病毒、調節免疫相關的蛋白質合成。IFN-β也參與了IFN-α的誘導，從而進一步增強了抗病毒反應[7]。但是，冠狀病毒是不斷變異進化的，可編碼多種蛋白來對抗IFN系統的抗病毒作用。研究表明，SARS-CoV的N蛋白具有拮抗宿主的IFN應答以逃避宿主抗病毒免疫的作用，MERS-CoV的M、4a蛋白可拮抗Ⅰ型IFN的合成[8]。

3.1.2 介導視黃酸誘導基因(RIG-I)樣受體(RLR)表達 RLR包括RIG-I(DDX58)、黑色素瘤分化相關基因(MDA-5)和LGP-2，主要識別RNA病毒的核酸。RLR具有DExD/H-box RNA解旋酶結構和C′末端終止結構(CTD)，而RIG-I和MDA-5具有N′末端胱天蛋白酶募集結構(CARD)，可與下游銜接子線粒體抗病毒信號蛋白(MAVS)相互作用。C端RNA解旋酶和CTD結構可以識別RNA[9,10]。RIG-I可被多種RNA病毒感染激活，包括CoVs、仙臺病毒(SEV)和丙型肝炎病毒(HCV)等。短雙鏈上含有三磷酸結構是病毒RNA的共同特征，而RIG-I可以識別5′端含有雙堿性酸的雙鏈RNA。當病毒的5′-三磷酸端被CTD結構識別時，ATP依賴性構象變化使CTD結構與雙鏈RNA形成復合物，之后CARD結構解除自我抑制狀態，并與MAVS相互作用[11]。晶體結構分析表明，與RIG-I一樣，MDA-5的解旋酶和CTD結構也被雙鏈RNA包圍，但是MDA-5的CTD結構缺少帽子結構(CTD與RNA 5′端的三磷酸相互作用需要帽子結構)，可以直接與雙鏈RNA相互作用[12]。

3.1.3 調節細胞凋亡 冠狀病毒是單股正義鏈RNA病毒，在復制的過程中產生雙鏈RNA(dsRNA)中間體。dsRNA是冠狀病毒特有的病原體相關分子模式(PAMP)，可引起一系列特定的免疫反應。巨噬細胞具有多個dsRNA檢測器，具有檢測病毒感染和增強先天抗病毒免疫的作用。dsRNA檢測器被激活將導致一系列反應，如IFN的產生、巨噬細胞快速凋亡和保護性免疫反應等。然而，許多冠狀病毒進化并適應宿主后，可在巨噬細胞中感染和傳播，同時并不會激活dsRNA檢測器，例如MERS-CoV的NSP4a、NSP4b、NSP15可抑制dsRNA檢測器激活。宿主的蛋白激酶R(PKR)可以磷酸化翻譯啟動因子2α(eIF2α)，抑制病毒翻譯。而MERS-CoV的NSP4a編碼一種dsRNA結合蛋白，可限制PKR激活[13]。當宿主檢測到病毒dsRNA時，可激活IFN誘導的寡腺苷酸合成酶(OAS)-RNase L途徑?；罨腞Nase L可切割病毒和宿主單鏈RNA，導致翻譯停滯和細胞死亡，以防止病毒復制和傳播。而MERS-CoV的NSP4b編碼磷酸二酯酶，可抑制RNase L的活性，從而增強病毒的復制和傳播能力，同時可導致細胞內IFN生成減少[14]。

3.2 適應性免疫應答

3.2.1 細胞免疫反應 T細胞尤其是CD4+T細胞和CD8+T細胞，在抗病毒過程中發揮重要作用。有研究采用ad5-hdp4轉染BALB/c小鼠以清除其體內T細胞，隨后將之與對照組和B細胞缺陷的小鼠進行比較，結果表明T細胞可以在感染小鼠的肺部存活，并破壞被感染的細胞，表明T細胞而非B細胞在抑制MERS-CoV感染的過程中發揮重要作用[15]。CD4+T細胞更容易受到MERS-CoV感染，其通過激活T細胞依賴性B細胞來促進病毒特異性抗體的產生。而CD8+T細胞具有細胞毒性，可以殺死病毒感染的細胞，并誘導免疫損傷。SARS-CoV可導致患者的肺間質被炎癥細胞浸潤，CD8+T細胞約占浸潤細胞總數的80%[16]。此外，SARS-CoV感染時，CD8+T細胞的損耗不會影響病毒復制；而CD4+T細胞的耗竭會導致肺部浸潤的淋巴細胞、中和性抗體和細胞因子減少，從而導致嚴重的間質性肺炎和病毒清除延遲。在冠狀病毒感染后期，T細胞的耗竭可能會延長病毒感染時間，并促進病毒存活。另外，輔助性T細胞可通過NF-κB信號通路產生促炎細胞因子；其中，IL-17可將單核細胞和中性粒細胞募集到炎癥感染部位，并激活其他下游細胞因子和趨化因子級聯反應，例如IL-1、LL-6、IL-8、IL-21、TNF-β和單核細胞趨化蛋白1(MCP-1)等。有研究從處于SARS恢復期的患者中篩選了SARS-CoV特異性T細胞，并檢測到了針對SARS-CoV結構蛋白的記憶性T細胞反應；結果表明，T細胞對SARS-CoV S蛋白和其他結構蛋白(包括M和N蛋白)的反應是持久的(可持續長達感染后11年)[17]。該研究為設計由病毒結構蛋白組成的SARS疫苗提供了依據，也給新型冠狀病毒的疫苗研制提供了可靠參考。

對于SARS-CoV-2，最近有研究對2019年12月～2020年1月武漢市漢陽醫院收治的522例COVID-19患者的臨床資料進行回顧性分析，結果表明在感染SARS-CoV-2的患者(特別是ICU中的重癥患者)中，其總T細胞、CD4+T細胞、CD8+T細胞數量大大減少，且T細胞計數與血清IL-6、IL-10、TNF-α水平及患者生存率呈負相關關系；隨著患者的病情發展，T細胞上的衰竭標志物程序性死亡受體1(PD-1)和T細胞免疫球蛋白黏蛋白3(Tim-3)表達增加，T細胞進一步衰竭；提示在COVID-19患者中，IL-10、IL-6、TNF-α等細胞因子可能直接介導T細胞衰竭，由此建議ICU的高?；颊咴诩膊≡缙诓扇☆A防T細胞降低的治療方法可能會改善其疾病轉歸[18]。此外，柳葉刀雜志發表了首份COVID-19病死患者的病理報告，結果發現患者CD4+和CD8+T細胞數量顯著減少，但人類白細胞抗原DR(HLA-DR)和CD38雙陽性的T細胞比例升高，提示其處于過度激活狀態；CD8+T細胞中含有高濃度的細胞毒性顆粒，其中顆粒溶素和穿孔素雙陽性的細胞占30.5%；該研究指出，淋巴細胞減少是COVID-19患者的典型特征，T細胞過度激活和CD8+T細胞的高細胞毒性可能與患者病情較重、預后較差有關[19]。

3.2.2 體液免疫反應 體液免疫對控制冠狀病毒持續感染很重要，B細胞具有分泌相應抗體和免疫記憶的功能。體內的抗體反應是多種單克隆抗體(mAb)的動態性綜合反應過程，它們共同作用于病毒包膜糖蛋白(E)上的不同抗原結構域。體外實驗表明，人單克隆抗體m336與MERSCoV刺突蛋白的受體結合區相互作用，m336能有效地中和MERS-CoV，使患者肺部病毒RNA滴度降低40 000～90 000倍[20]。研究表明，用高滴度超免疫血漿或單克隆抗體m336可以緩解MERS-CoV感染猴子的臨床癥狀，但僅在超免疫血漿組中發現呼吸道病毒載量降低，且二者尚不能完全預防該疾病[21]。研究表明，與對照組相比，SARS-CoV感染后的雪貂能以更快的速度產生更強的中和性抗體反應，但其肝組織中也發生了強烈的炎癥反應，證明SARS-CoV的棘突蛋白表達升高與肝炎的發生及加重均密切相關[22]。

由于SARS-CoV和SARS-CoV-2的結構相似，并通過結合相同的宿主受體進入宿主，有研究檢驗了兩種病毒受體結合區(RBD)之間是否存在抗體交叉反應性；結果表明，靶向SARS-CoV RBD的單克隆抗體并不結合SARS-CoV-2的RBD，SARS-CoV的單克隆抗體不具備免疫交叉反應性，對SARS-CoV-2的感染無效[23]。最近的一項前瞻性隊列研究對34例SARS-CoV感染的醫護人員進行了長達13年的跟蹤調查，結果顯示其抗SARS-CoV IgG滴度在2004年達峰后逐漸下降，直到2015年仍保持在很高的水平；該研究提示，冠狀病毒感染后機體發生體液免疫應答，可提供長達12年的保護性免疫力[24]。

3.2.3 補體系統應答 補體系統是宿主對抗冠狀病毒感染的免疫應答的重要組成部分。補體系統有助于先天性免疫系統檢測和抵抗外來抗原，也是適應性免疫系統中具有宿主敏感性且非特異性的補充體系[25]。過度的補體反應可損害宿主組織，因此可以通過適度抑制血清中的蛋白來嚴格控制補體系統。C3是補體系統的重要組成成分，有研究以C3缺陷型小鼠與C57BL/6J小鼠為研究對象，驗證了補體系統在SARS-CoV發病機制中的作用。結果顯示盡管兩者肺內的病毒載量相同，但是C3缺陷型小鼠肺組織及血清中的細胞因子及趨化因子水平降低，呼吸障礙程度輕；提示SARS-CoV感染后激活的補體系統可以調節全身性促炎反應。

綜上所述，宿主的先天性及適應性免疫系統實現了對病毒的高效性殺傷清除，宿主免疫功能不全會使得病毒復制增加，而過強的免疫反應會誘發免疫病理狀況，導致組織損傷；另一方面，病毒已進化出多種機制來逃避和拮抗宿主的免疫反應，如逃避體液免疫識別、干擾細胞免疫應答能力、干擾免疫效應因子功能等[26,27]。因此，了解冠狀病毒與宿主免疫系統間的相互作用是科學防治該病毒的基礎。