血清HBV pgRNA與HBV cccDNA的關系及其臨床意義研究進展

張詩琬，喻雪琴，陳芳，陳星，戢敏，梅小平

川北醫學院附屬醫院，四川南充637000

以乙肝病毒(HBV)共價閉合環狀DNA(HBV cccDNA)為模板進行HBV RNA逆轉錄是HBV復制的初始環節，HBV cccDNA的存在是HBV持續感染的標志[1,2]。目前，即使患者血清中HBV DNA、乙肝表面抗原(HBsAg)消失或發生血清學轉換，但肝細胞核中仍存在HBV cccDNA而無法被藥物清除，肝細胞核內少量HBV cccDNA即可導致HBV相關性肝病患者病情復發。由于HBV cccDNA存在于肝細胞內，需要進行創傷性肝穿刺活組織檢測，且HBV cccDNA在肝內呈不均勻分布，因此HBV cccDNA的精準檢測難以在臨床中廣泛開展，臨床上亟需尋找新的血清標志物來準確反映肝組織中HBV cccDNA的表達水平以及轉錄程度。2018版歐洲肝病學會《慢性乙型肝炎病毒感染管理臨床實踐指南》及2019版《慢性乙型肝炎防治指南》中均增加了3種新型HBV檢測生物學標志物，其中包括血清HBV前基因組(HBV pgRNA)[3]。但目前血清HBV pgRNA檢測并未在臨床推廣應用，可能與其在血清中表達較低、相關研究數據少及尚未形成統一檢測標準等有關[4]。本文就血清HBV pgRNA與HBV cccDNA的關系及其臨床意義作一綜述。

1 血清HBV pgRNA與HBV cccDNA的關系

1.1 血清HBV pgRNA概述 德國學者Kock等[5]在1996年從CHB患者血清中首次檢出了HBVRNA，隨后HBV RNA迅速成為國內外學者的研究熱點，關于HBV RNA的相關報道不斷出現。Tanaka等[6]利用蔗糖梯度離心法發現，HBV RNA與HBcAg、HBV DNA結構類似，并明確指出HBV RNA為乙肝病毒顆粒的核心成分。Wang等[7]利用免疫印跡技術排除相關干擾因素，發現在11例進行核苷(酸)類(NAs)藥物初治的CHB患者血清中存在HBV RNA，是一種長度為3.5 kb的RNA；隨后研究人員利用引物擴增及多重PCR技術，對接受NAs藥物處理的HepAD38和HepG2.2.15細胞上清液進行檢測，證實CHB患者血清中長度為3.5 kb的RNA就是HBV pgRNA。

以HBV cccDNA為模板轉錄出的HBV pgRNA在逆轉錄過程中會被降解，血清中HBV pgRNA的存在可能是因為NAs藥物抑制了其逆轉錄過程，導致血清中HBV pgRNA累積而表達升高。研究發現，血清HBV pgRNA可能是肝細胞中的pgRNA在開始逆轉錄之前直接獲得包膜，并從肝細胞中釋放入血所致，因該病毒顆粒中含有HBV RNA，又稱之為“HBV RNA病毒樣顆粒”[8]。郭濛濛[9]對Nas治療前后CHB患者血清HBV RNA水平進行對比發現，患者治療后血清HBV RNA水平升高，并推測血清中存在的HBV pgRNA是由肝細胞核中的HBV cccDNA轉錄而來。

1.2 血清HBV pgRNA與HBV cccDNA的相互關系 HBV感染人體后即侵入正常肝細胞，隨后HBV DNA脫去核殼成為松弛環狀雙鏈DNA(rcDNA)[10]。rcDNA是由正負兩條鏈組成，負鏈中由幾個堿基形成“缺口”，rcDNA進入肝細胞核后，在依賴HBV編碼的DNA聚合酶作用下填補缺口，進行折疊、扭轉等過程，成為超螺旋結構的HBV cccDNA[11]；同時細胞以HBV cccDNA為模板，轉錄出3.5、2.4、2.1、0.7 kb四種不同長度的mRNA，再合成多種病毒蛋白[11]。3.5 kb長的RNA有兩種表達模式，一種為可編碼乙肝e抗原(HBeAg)相關蛋白的pre-C mRNA，另一種為逆轉錄模板的pgRNA；該RNA可利用逆轉錄酶合成rcDNA中的負鏈，再以此為模板，在DNA聚合酶介導下合成正鏈DNA，正、負鏈DNA重新組合成為新的HBV rcDNA。新的HBV rcDNA一部分再入肝細胞核轉化成為新的HBV cccDNA，另一部分與病毒蛋白重新組裝釋放到肝細胞外，成為有完整病毒顆粒的HBV DNA，再感染新的正常肝細胞[12,13]。因此，HBV pgRNA是HBV cccDNA的轉錄產物，以病毒顆粒形式表達于HBV相關性肝病患者的血清中。

2 血清HBV pgRNA檢測的臨床意義

2.1 反映HBV cccDNA的存在狀態 HBV pgRNA在逆轉錄之前獲得包膜，在感染肝細胞中以病毒顆粒方式釋放入血。與HBsAg的多個來源不同，血清中HBV pgRNA的惟一來源是HBV cccDNA，每個感染HBV的肝細胞內均存在一定量HBV cccDNA，是HBV pgRNA的惟一轉錄模板。從理論上講，血清HBV pgRNA水平可反映肝細胞HBV cccDNA水平及其轉錄活性，且血清HBV pgRNA檢測方法簡便易行、操作性強、患者易接受，是反映HBV cccDNA水平較為可靠的指標[2]。

自1998年應用NAs進行抗HBV治療以來，臨床上就存在患者抗HBV治療停藥后HBV復發率高的問題，抗HBV治療還可引起酪氨酸-甲硫氨酸-天門冬氨酸-天門冬氨酸(YMDD)變異。郭濛濛[9]在找尋YMDD變異預測標志物時發現，發生YMDD的患者體內HBV pgRNA表達升高；表明血清HBV pgRNA高表達可能是HBV cccDNA的轉錄形式及HBV RNA肝內組裝的標志，即檢測血清HBV pgRNA表達對預測YMDD發生有一定預測價值。李惠姣[14]通過建立體外TDF抗病毒細胞模型，并觀察細胞上清液HBV pgRNA、HBV DNA、HBsAg與細胞內HBV cccDNA的關系；結果發現，細胞上清液HBV pgRNA水平與HBV cccDNA呈顯著正相關關系，且HBV DNA、HBsAg水平反映HBV cccDNA水平及復制轉錄的敏感度均明顯低于HBV pgRNA。有報道指出，CHB患者肝組織HBV pgRNA與HBV cccDNA水平可反映患者體內HBV的復制水平，隱匿性HBV感染者HBV pgRNA與HBV cccDNA水平明顯低于HBsAg陽性患者，表明HBV pgRNA與HBV cccDNA對HBV感染者體內HBV活躍程度的預測價值均高于HBsAg[15]。Lu等[16]對33例結束抗HBV治療后的CHB患者進行血清檢測，結果顯示所有患者血清HBV DNA為陰性或低于檢測下限，但仍有21例在隨訪24周后檢出血清HBV pgRNA且均發生了病毒學復發；提示即使CHB患者血清中檢測不到HBV pgRNA也不能表示肝細胞內HBV cccDNA消失或停止轉錄，但檢測不到HBV pgRNA可使患者停藥后的復發率大大降低。因此，對于慢性HBV感染者經過抗HBV治療HBV DNA陰轉之后的病情評估、療效判斷、停藥時機選擇及是否發生YMDD變異等，血清HBV pgRNA水平檢測均具有非常重要的指導作用。

2.2 預測HBeAg血清學轉換 研究發現，在CHB患者接受NAs治療的過程中，HBV DNA下降到低水平時，HBeAg陽性者HBV pgRNA檢出率高于HBeAg陰性者；這可能與HBeAg陽性者肝細胞內HBV cccDNA較為活躍有關，即血清HBV pgRNA水平可反映患者體內HBV的復制狀態，HBeAg是影響血清HBV pgRNA水平的因素之一[19]。Berg等[20]研究發現，在采用阿德福韋酯進行抗HBV治療的17例患者中，11例HBeAg陽性患者中有5例出現血清學轉換，且與未發生血清學轉換的患者相比，發生HBeAg血清轉換者血清HBV RNA水平明顯降低；該研究認為，血清HBV pgRNA可能成為預測HBeAg血清轉換的指標之一，與Huang等[21]的研究結果類似。彭亞夢等[22]在HBeAg陽性患者血清中發現HBV pgRNA與HBeAg具有顯著相關性，但在HBeAg陰性患者血清中并未發現此種相關性；提示HBeAg不僅可以從HBV cccDNA轉錄而來，還可由整合的HBV DNA產生。因此，HBeAg在反映患者療效上有一定缺陷，而HBV pgRNA能直接準確地反映患者抗HBV治療的近遠期療效。

2.3 反映乙肝核心相關抗原(HBcrAg)表達水平 HBcrAg是近年發現的HBV感染的新型血清檢測標志物之一，是由前C基因及C基因編碼的HBcAg、HBeAg、p22cr組成的組合性標志物，這3種蛋白質共擁有149個氨基酸序列長度，對于預測HBV感染者抗HBV治療的療效及選擇停藥時機具有重要的臨床應用價值。Seto等[23]研究發現，HBcrAg可反映肝細胞內HBV cccDNA的水平及活躍程度，同時與血清HBV DNA及肝細胞內HBV DNA水平呈顯著正相關關系，且相關系數高于HBsAg與HBV cccDNA之間的相關系數；表明作為HBV cccDNA的替代檢測標志物，HBcrAg較HBsAg具有更高的價值。對HBsAg陰性的乙肝病毒攜帶者進行免疫抑制劑治療時，患者發生HBV再活躍的重要因素就是血清HBcrAg陽性；提示HBcrAg可能成為患者接受預防性抗HBV治療的重要評價指標，同時對患者抗HBV治療后監測停藥后HBV再復制的風險具有較高預測價值[24,25]。研究發現，CHB患者經NAs抗HBV治療后，HBcrAg陽性者血清HBV pgRNA、HBV cccDNA及HBV DNA復制水平均明顯高于陰性者，提示HBV pgRNA可在一定程度上反映HBcrAg表達情況[26]。血清HBV pgRNA、HBcrAg均可作為反映HBV cccDNA水平的無創性代替血清學指標，相比之下，HBV pgRNA來源惟一，是HBV cccDNA的直接產物，其準確性比HBcrAg更高。

2.4 反映HBV DNA、HBsAg水平變化 HBV DNA、HBsAg是目前診斷HBV感染最基本的血清學指標，有助于評估患者病情狀況、預測抗HBV療效、預測抗HBV應答程度和選擇停藥時機等。研究發現，血清HBV DNA及HBsAg可作為反映HBV cccDNA水平的無創替代血清學指標之一[27]。臨床上CHB患者血清中HBV DNA消失或低于檢測值下限后經鞏固抗HBV治療，其停藥后復發率仍較高，這可能與肝細胞內HBV cccDNA沒有被完全清除有關。HBV DNA是由HBV pgRNA逆轉錄而來，而HBV pgRNA由HBV cccDNA轉錄而來，即HBV DNA水平同時受到HBV pgRNA、HBV cccDNA水平的影響。NAs抗HBV治療只作用于HBV的逆轉錄過程，可阻斷HBV pgRNA逆轉錄，使HBV DNA合成受到抑制，但HBV cccDNA仍可以HBV RNA病毒樣顆粒模式合成新的HBV顆粒。因此，NAs抑制CHB患者HBV pgRNA逆轉錄后，其血清HBV DNA水平下降，但HBV cccDNA下降緩慢，在HBV DNA低于檢測值下限時，HBV cccDNA仍可能存在陽性表達[14]。

目前已有的抗HBV治療方法尚達不到完全治愈的治療目標，只能達到功能性治愈，即血清中檢測不到HBV DNA、HBsAg，和(或)發生HBsAg血清轉換。HBsAg主要是由HBV cccDNA發生轉錄后合成2.4、2.1 kb的mRNA翻譯出來的病毒蛋白，抗HBV治療并不能直接對其翻譯過程產生阻斷作用，因此患者血清HBsAg水平下降十分緩慢。Giersch等[28]研究顯示，接受NAs治療的患者血清中低水平的HBsAg還可能來源于HBV DNA。研究發現，HBsAg的來源不僅是HBV cccDNA，也可由整合的HBV DNA轉錄而來[29]。由于肝細胞更新周期長，導致來源于整合HBV DNA的HBsAg表達非常穩定，這導致了HBsAg用于反映HBV cccDNA水平和治療效果的準確性較低。

2.5 預測抗HBV治療療效 肝細胞內HBV cccDNA存在是HBV持續或反復感染的最關鍵因素，肝細胞內低水平的HBV cccDNA是患者接受治療后HBV復發的關鍵點。血清HBV pgRNA的唯一來源僅為HBV cccDNA，可作為HBV cccDNA轉錄產物、替代反映肝細胞內HBV cccDNA水平及HBV活躍程度的良好指標，對于評價抗HBV療效、藥物應答程度、停藥時機選擇、HBV基因突變與耐藥及預測停藥后復發風險、肝細胞癌發生風險和術后復發風險均具有較高價值。血清HBV pgRNA指標可反映肝組織病原學狀態，創傷性小，患者接受程度高。

綜上所述，新型血清標志物HBV pgRNA可反映HBV cccDNA的存在狀態、預測HBeAg血清學轉換、反映HBcrAg表達水平、反映HBV DNA、HBsAg水平變化、預測抗HBV治療療效等，在反映CHB患者病情、評估療效、選擇停藥時機及預測停藥后疾病復發風險等方面均具有較高的臨床價值。但目前HBV pgRNA檢測技術尚未完全成熟，仍處于大量研究階段，且存在許多問題尚待解決，如HBV pgRNA是否能準確地反映HBV cccDNA的存在狀態，HBV pgRNA作為停藥指標的價值是否優于HBsAg等。未來利用逆轉錄PCR法對HBV pgRNA檢測技術進行完善，再將其與HBsAg、HBcAg、HBcrAg、HBV DNA等指標結合，對CHB患者的綜合評價體系將更加完善。