刀豆球蛋白A 誘導的葡聚糖納米凝膠高層級自組裝

徐 源， 劉靈珊， 王 灝， 竇紅靜

（上海交通大學材料科學與工程學院金屬基復合材料國家重點實驗室，上海 200240）

分子間的特異性識別是生命過程的核心。蛋白質-糖的相互作用被認為是很多細胞識別過程的基礎，其中凝集素-糖的相互作用越來越受到關注。凝集素-糖之間的特異性識別作用在細胞黏附、生物信號傳導、免疫反應等多種生物過程中扮演著重要角色。凝集素是一類非免疫來源的蛋白質，沒有催化活性，每個凝集素分子通常含有兩個或多個碳水化合物結合位點，能夠選擇性地識別并可逆地結合存在于糖蛋白和糖脂上的特定游離糖或聚糖[1-3]。研究凝集素與糖類，尤其是與多糖這類來源廣泛的生物大分子間的相互作用，并基于多糖-凝集素間的相互作用來構筑高層級組裝體，無疑對拓展多糖的生物功能具有重要意義。凝集素在糖蛋白研究中具有巨大的潛力和價值[4,5]，同時凝集素-糖相互作用還可以用于生物傳感器[6]、抗艾滋?。℉IV）[7-9]、抗腫瘤[10,11]、免疫治療[12-15]等生物醫用領域。

作為一種從刀豆中提取的植物凝集素，刀豆球蛋白A（Con A）與葡萄糖和甘露糖之間的特異性結合可作為一種有效驅動力來構筑自組裝體。Con A 與葡萄糖和甘露糖之間的特異性結合具有Ca2+/Mn2+依賴性[16]，單糖可以直接通過氫鍵和范德華力錨定于蛋白質[17]。作為一種生物相容性良好的天然多糖，葡聚糖結構中含有多個葡萄糖單元，因而同樣可以與Con A 結合[18-20]，但結合力弱于葡萄糖單糖，可與Con A-葡萄糖之間的相互作用形成競爭結合[21,22]。Bevan 等[23]證實了Con A 通過與葡聚糖的識別作用可以促進葡聚糖納米膠體粒子的聚集，且聚集程度與Con A 的濃度有關。利用特異性識別葡萄糖/葡聚糖的性質，Con A 可用于構筑葡萄糖傳感器[24,25]。Con A 的使用質量濃度一般較低（0.05～10 μg/μL）[26]，這是因為Con A 本身具有一定的細胞毒性。Con A 對腫瘤細胞的抗增殖機理目前仍不太明確，普遍認為Con A 可以誘導程序性細胞死亡，包括自噬和細胞凋亡[10,27-29]。Lei 等[30]證實Con A 一旦與細胞膜糖蛋白上的甘露糖部分結合，就優先內化于線粒體，然后誘導BNIP3 介導的線粒體自噬，促使腫瘤細胞死亡。同時，Con A 也是誘導小鼠自身免疫性肝炎的T 細胞有絲分裂原，通過細胞自噬和免疫調節的雙重作用，Con A 可發揮有效的抗肝癌治療效果。Liu 等[31]報道Con A 對HepG2 細胞抑制效果的劑量和時間依賴性，其半抑制質量濃度（IC50）為20 μg/mL。Bao 等[11]報道Con A 在人黑素瘤A375 細胞中誘導半胱天冬酶依賴性的細胞凋亡，同時用甘露糖與Con A 提前共孵后能夠抑制Con A 與A375 細胞表面的甘露糖結合，從而有效地降低Con A 的抗增殖效果。淋巴細胞對Con A的敏感性高于腫瘤細胞，也可能是由于它們在細胞膜上的甘露糖或葡萄糖含量更高[29]。因此，以Con A 為主要組成構筑的納米組裝體將在癌癥治療領域具有良好的研究前景。

葡聚糖因具有優異的生物相容性和獨特的生物功能性而成為構筑生物功能材料的重要物質。本文采用接枝共聚誘導自組裝法(GISA)合成葡聚糖納米凝膠[32-34]，該納米凝膠可作為藥物運輸、生物顯影材料的載體，合成方法便捷并能實現宏量制備。借助葡聚糖與Con A 的識別結合，以葡聚糖納米凝膠為結構單元進一步構建尺寸更大的高層級自組裝體，實現了以分子識別為驅動力的高層級自組裝。該高層級自組裝體的功能性要強于原葡聚糖納米凝膠。一方面不同于以往報道中，利用共價鍵作用在葡聚糖納米凝膠中負載藥物，在本文體系中Con A 不但可以作為高層級自組裝的連接橋梁，而且還可以發揮其本身對癌細胞的抑制作用；另一方面，由于不占用特征官能團，該高層級自組裝體依舊具備原葡聚糖納米凝膠的相關功能。同時，本文探究了Con A 本身及含有Con A 的高層級自組裝體對人非小細胞肺癌A549 細胞的抑制作用。

1 實驗部分

1.1 原料和試劑

葡聚糖（Dex，Mw=4.0×104）、二甲基亞砜（DMSO）、硝酸鈰銨（CAN）：分析純，國藥集團化學試劑有限公司；丙烯酸甲酯（MA）：分析純，國藥集團化學試劑有限公司，氫化鈣干燥過夜并減壓蒸餾；二烯丙基二硫醚（DADS）：純度80%，Sigma Aldrich，減壓蒸餾后使用；4-羥乙基哌嗪乙磺酸（HEPES）：w≥99.5%，Sigma Aldrich；無水氯化鈣（CaCl2）：w=99.9%，上海麥克林生化科技有限公司；氯化錳（Ⅱ）四水合物（MnCl2·4H2O）：w＞98.0%，梯希愛（上海）化成工業發展有限公司；Con A：w＞95.0%，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；人非小細胞肺癌A549 細胞：中科院上海細胞庫；RPMI-1640 培養基、胎牛血清蛋白： Biological Industries 公司；胰酶（每100 mL 消化液中含有0.25 g 胰酶）、青霉素、鏈霉素、磷酸鹽緩沖液：Gibco 公司；CCK-8 試劑盒（Cell Counting Kit-8）：上海碧云天生物技術有限公司。

1.2 測試與表征

粒度分析儀（英國Malvern 公司Nano Sizer ZS90 型）：樣品質量濃度為1 mg/mL，測試溫度為25 ℃，測3 次取平均值；生物型透射電子顯微鏡BIO-TEM (美國FEI 公司Tecnai G2 spirit Biotwin 120 kV 型)：將3 μL 樣品（0.75 mg/mL）滴在普通碳支持膜上，在水溶液體系中磷鎢酸負染后觀察，或在HEPES 緩沖溶液體系中直接干燥后觀察；核磁共振光譜儀（德國Avance Ⅲ，400 MHz）：將納米凝膠凍干后溶于氘代DMSO 中測試；傅里葉紅外光譜儀（美國Thermo Fisher 公司Nicolet 6700 型）：取樣品粉末2～5 mg，與溴化鉀充分研磨壓片后測定；紫外-可見光吸收光譜（日本Shimadzu 公司UV-2550 型）；等溫滴定量熱儀（美國GE 公司ITC 200）；生物安全柜（青島海爾股份有限公司HR40-IIB2 型）；冷凍離心機（德國Eppendorf 公司5810R 型）；酶標儀（美國Bio-Rad 公司xMark 型）。

1.3 接枝共聚誘導自組裝法制備葡聚糖納米凝膠

取葡聚糖2.5 g 溶于50 mL 超純水中，80 ℃下攪拌直至完全溶解。冷卻至30 ℃，氮氣保護下加入引發劑CAN（1.168 g，溶于1.25 mL 0.1 mol/L 硝酸中）。反應5 min 后，加入MA（0.674 mL），30 min 后再加入交聯劑DADS（0.948 mL，溶于2.5 mL DMSO 中），繼續反應4 h。反應結束后，將樣品轉移到截留分子量為1.4×104的透析袋中，透析3 d 除去沒有反應的原料。凝膠樣品置于4 ℃的冰箱中保存。

1.4 等溫滴定量熱法對Con A 與葡聚糖納米凝膠相互作用的表征

取一定量的Con A 溶于HEPES 緩沖溶液（10 mmol/L HEPES，1 mmol/L Ca2+，1 mmol/L Mn2+）中，Con A 溶液的濃度為0.05 mol/L。葡聚糖納米凝膠的水溶液通過透析的方式換為HEPES 緩沖溶液體系。實驗前多次清洗儀器，并做空白實驗（水滴定水）確保儀器狀態良好。葡聚糖納米凝膠溶液與Con A 溶液脫氣后，分別加到40 μL 注射器和200 μL 樣品池中進行滴定。

1.5 Con A-葡聚糖作用下的納米凝膠高層級自組裝

向葡聚糖納米凝膠溶液中加入一定量1 mg/mL 的Con A 溶液，750 r/min 振蕩混合30 min。葡聚糖納米凝膠與Con A 的質量比分別為100，50，10，5 和2。

1.6 高層級自組裝納米凝膠的細胞毒性

A549 細胞以每孔104的密度接種于96 孔板，使用體積分數10%的胎牛血清、體積分數1%的雙抗的RPMI-1640 培養基，置于37 ℃，5%體積分數CO2培養箱中培養。細胞貼壁后棄去上清液，每孔加入100 μL不同濃度的葡聚糖凝膠或高層級自組裝體的完全培養基溶液，孵育48 h 后，棄去上清液，每孔加入100 μL 無血清培養基和10 μL CCK-8 試劑，繼續孵育1 h。采用酶標儀測定450 nm 處的吸光度。

2 結果與討論

2.1 葡聚糖納米凝膠的制備與表征

通過接枝共聚誘導自組裝法制備葡聚糖納米凝膠（Dex NG）。首先利用硝酸鈰銨在葡聚糖分子鏈上引發自由基，丙烯酸甲酯單體在自由基處發生聚合形成接枝共聚物；然后在疏水力的作用下誘導納米凝膠的形成；最后再加入交聯劑對結構進行固定。該方法可以一步、高效地制備葡聚糖納米凝膠，且該納米凝膠的粒徑取決于葡聚糖中的單糖（Glu）與丙烯酸甲酯的物質的量之比[32,34]，本文按nGlu/nMA=2∶1 進行投料。動態光散射測得葡聚糖納米凝膠的流體力學粒徑為53.6 nm，PDI 為0.119，Zeta 電位為-2.38 mV，如圖1（a，b）所示。由于葡聚糖納米凝膠的襯度較小，需用磷鎢酸負染后觀察。從TEM 圖像（圖1（c））上可以看到，葡聚糖納米凝膠呈規則的球狀且分布均勻，平均粒徑為32.4 nm，該粒徑小于動態光散射表征所得結果，這是由于葡聚糖納米凝膠在液體狀態下吸水膨脹，干燥狀態下失水收縮。

圖 1 水溶液體系中葡聚糖納米凝膠的表征：（a）流體力學直徑分布圖；（b）Zeta 電位；（c）TEM 圖像；（d）1H-NMR 譜圖Fig. 1 Characterization of Dex NG @ Water: （a） Hydrodynamic diameter; （b） Zeta potential; （c） TEM image and （d）1H-NMR spectrum

葡聚糖納米凝膠的核磁共振氫譜如圖1(d)所示。葡聚糖分子鏈上的氫特征化學位移主要分布在3～5。1～4 區域內存在聚丙烯酸甲酯鏈上的氫特征化學位移，其中1.2～2.4 的特征峰對應于聚丙烯酸甲酯分子鏈中亞甲基和次甲基的化學位移，而甲基的化學位移對應的是3.5～3.6 的強峰。由此可見，納米凝膠主要組成為葡聚糖和丙烯酸甲酯。對譜峰進行積分，該葡聚糖納米凝膠中存在3 個單糖和1 個丙烯酸甲酯單元，即葡聚糖納米凝膠中nGlu/nMA為3∶1，大于其投料比2∶1，說明在反應過程中部分丙烯酸甲酯單體未接枝到葡聚糖上，未反應的單體在反應結束后通過透析被除去。

Con A 本身的構象對環境有一定的依賴性。研究表明，當pH 為2～5.5 時，Con A 以二聚體形式存在；當pH 高于5.5 時，Con A 主要以四聚體的形式存在[35]。Con A 還具有Ca2+/Mn2+依賴性，且每個Con A 單體單元具有一個結合位點。因此本文中，將Con A 溶于HEPES 緩沖溶液中，體系pH 為7.2～7.4，并向其中加入適量的Ca2+和Mn2+。采用透析的方法將葡聚糖納米凝膠從水溶液體系(Dex NG @ Water)置換到HEPES 緩沖溶液中(Dex NG @ Buffer)以保證Con A 在高層級自組裝過程中的活性。葡聚糖納米凝膠在HEPES 緩沖溶液中也能夠保持均勻穩定的狀態，其DLS 和TEM 表征結果如圖2 所示。在HEPES 緩沖溶液中，葡聚糖納米凝膠的流體力學粒徑為54.4 nm，PDI 為0.148，與在水溶液中相比納米凝膠的粒徑幾乎沒有發生改變。此時，葡聚糖納米凝膠的Zeta 電位為-1.33 mV，略高于分布于水溶液時的Zeta 電位，這可能是由于HEPES 緩沖溶液體系中存在陽離子造成的。圖2（c）的TEM 圖像顯示，葡聚糖納米凝膠在干燥狀態下也呈現出規則的球形，平均粒徑為46.0 nm，同樣也略小于溶液狀態中的流體力學粒徑。

2.2 葡聚糖納米凝膠的高層級自組裝

圖 2 HEPES 緩沖溶液體系中葡聚糖納米凝膠的表征：（a）流體力學直徑分布圖；（b）Zeta 電位；（c）TEM 圖像Fig. 2 Characterization of Dex NG @ Buffer: （a） Hydrodynamic diameter; （b） Zeta potential and （c） TEM image

目前有關葡聚糖與Con A 組裝體的研究大多是利用兩者的相互作用將Con A 修飾在表面含有葡聚糖的納米結構上[20,21,23]。不同于以往的研究，本文提出利用Con A 與葡聚糖納米凝膠體系表面葡聚糖分子鏈段之間的相互作用構筑高層級自組裝體，制備方法簡便高效，只需通過混合葡聚糖納米凝膠和Con A 溶液即可制備高層級自組裝體Con A-Dex NG。

高層級自組裝體的FT-IR 譜圖如圖3 所示。圖中藍色的為葡聚糖的紅外圖譜。由于葡聚糖中含有較多―OH，故3 500 cm-1附近出現的特征吸收峰寬而強，歸屬于―OH 的伸縮振動。2 890 cm-1處的峰為飽和烷烴結構―CH2―的伸縮振動峰，1 300～1 000 cm-1處的峰則對應于葡聚糖環內與環間的C―O。Dex NG @Water、Dex NG @ Buffer 和Con A-Dex NG 的譜線中都出現了葡聚糖的特征峰。此外，葡聚糖納米凝膠的紅外圖譜中，在1 737 cm-1處存在C＝O 的伸縮振動峰，對應于丙烯酸甲酯中的羰基，再次證明了丙烯酸甲酯接枝共聚反應的發生。Con A-Dex NG 高層級自組裝體的特征峰與葡聚糖納米凝膠基本重合，并在1 529 cm-1處存在Con A 的特征峰，由此可以證明最終的高層級自組裝體中確實有Con A 的存在。

圖 3 樣品的紅外圖譜Fig. 3 FT-IR spectra of samples

等溫滴定量熱法（ITC）已被用于研究碳水化合物和凝集素之間的結合相互作用[19,36,37]。本文首次通過ITC 驗證了葡聚糖納米凝膠組裝體與Con A 的相互作用。由于Con A 和葡聚糖納米凝膠均溶解在HEPES緩沖溶液中，首先將HEPES 緩沖溶液滴加到Con A 溶液中得到溶液的稀釋熱。再把葡聚糖納米凝膠逐滴加入到Con A 溶液中，扣除稀釋熱后得到圖4 所示的放熱曲線。在葡聚糖納米凝膠中，丙烯酸甲酯具有一定的疏水性從而傾向于集中在納米凝膠的內部，因此納米凝膠的表面會存在較多親水性葡聚糖鏈段。Con A能夠識別結合葡聚糖納米凝膠表面的葡聚糖鏈段，從而放出熱量。

圖 4 Con A 與Dex NG 相互作用的放熱曲線Fig. 4 Exothermic curve showing the interaction between Con A and Dex NG

該高層級自組裝體的粒徑可以通過改變葡聚糖納米凝膠同Con A 的質量比（mNG/mConA）進行調控。如表1 所示，高層級自組裝體的粒徑隨著mNG/mConA的減小而逐漸增大，Zeta 電位也呈現出相同的變化趨勢。隨著Con A-Dex NG 粒徑的增加，整個體系水溶液在300～800 nm 的光學吸收也逐漸增強（圖5（a））。與此同時，宏觀上溶液也隨之變得渾濁。當mNG/mConA=2 時，體系中出現明顯的白色沉淀（圖5（b））。

表 1 mNG/mCon A 對Con A-Dex NG 流體力學粒徑、粒徑分布和Zeta 電位的影響Table 1 Influence of mNG/mCon A on hydrodynamic diameter, PDI and Zeta potential of Con A-Dex NG

圖 5 Con A-Dex NG 的紫外-可見吸收光譜（a）和圖像（b）Fig. 5 UV-Vis spectra （a） and image （b） of Con A-Dex NG

綜上所述，高層級自組裝過程可能存在的機理如圖6 所示。當體系中Con A 非常少時，Con A 通過與葡聚糖的結合位點修飾在少量的Dex NG 表面，此時Con A-Dex NG 與Dex NG 的粒徑、Zeta 電位均相差不大。隨著Con A 的增多，越來越多的Dex NG 表面被Con A 修飾，由于此時Con A 以四聚體的形式存在，以Con A為連接點可以將多個Dex NG 連接在一起形成新的粒徑較大的納米凝膠。

圖 6 Con A-Dex NG 高層級自組裝體制備示意圖Fig. 6 Scheme of the fabrication of Con A-Dex NG high order self-assembly

該高層級自組裝機理的推測被TEM 結果進一步證明。如圖7 所示，當mNG/mConA=10 時，Con A-Dex NG 呈均勻分布的球形，粒徑約為90.8 nm，其形貌與圖2（c）所示的納米凝膠相仿，但粒徑略大，粒徑的增大與納米凝膠表面的Con A 分子層有關。當Con A 繼續增多時，更多的Dex NG 在Con A 作用下發生高層級自組裝，形成粒徑更大的納米團聚體。如圖7（c）所示，當mNG/mConA=5 時，Con A-Dex NG 的粒徑為143.1 nm，呈規則的球形，且此時納米凝膠的襯度明顯增加，側面證明此時Con A-Dex NG 是由多個Dex NG 自組裝而成。在此基礎上再增加Con A，比如當mNG/mConA=2 時，足夠多的Dex NG 團聚在一起形成了肉眼可見的沉淀。

圖 7 Con A-Dex NG 高層級自組裝體的TEM 照片Fig. 7 TEM images of Con A-Dex NG high order self-assembly

2.3 細胞毒性

Con A 已顯示出對多種癌細胞的抑制效果，如A375、HepG2、U87 膠質瘤母細胞等[35]，但Con A 對肺癌細胞是否同樣具有抑制作用尚未得到證明。本文選取非小細胞肺癌A549 細胞，分別探究了游離的Con A 和含有Con A 的高層級自組裝體Con A-Dex NG 對A549 細胞的抑制作用。本課題組已經證明水溶液中的葡聚糖納米凝膠對人臍靜脈內皮細胞HUVEC、人乳腺癌細胞MCF-7 和MDA-MB-231 以及人宮頸癌細胞HeLa 均具有良好的生物相容性[34]。本文證明了該葡聚糖納米凝膠對A549 細胞的低毒性。如圖8（a）所示，當原始葡聚糖納米凝膠質量濃度達到500 μg/mL 時，細胞依舊能夠達到幾乎100%的細胞活性。透析到HEPES 緩沖溶液體系中后，葡聚糖納米凝膠依舊具有很好的生物相容性，但由于Ca2+和Mn2+的加入，細胞活性稍有降低，但都保持在90%以上。圖8（b）證實游離的Con A 對A549 細胞具有殺傷作用，且存在濃度依賴性。當Con A的質量濃度為10 μg/mL 時，僅有40%的細胞可以存活，而當Con A 的質量濃度為20 μg/mL 時，細胞的死亡率可以達到90%以上。Con A-Dex NG 高層級自組裝體對A549 細胞也存在抑制作用，且隨著Con A 質量濃度的增加而增加。由此可見，高層級自組裝過程并不會影響Con A 的抗腫瘤活性。同時葡聚糖納米凝膠本身也可作為載體負載抗腫瘤藥物，故該高層級自組裝體在多功能診療方面可能存在廣闊的應用前景。

圖 8 A549 細胞的細胞毒性：（a）水溶液體系中和HEPES 緩沖溶液體系中的Dex NG；（b）游離Con A 和Con A-Dex NGFig. 8 A549 cell viability: （a） Dex NG@Water and Dex NG@Buffer; （b） Free Con A and Con A-Dex NG

3 結 論

（1）基于GISA 法所得葡聚糖納米凝膠表面存在的葡聚糖與凝集素Con A 之間的特異性識別作用，可以構筑主要組成為多糖和凝集素的高層級自組裝體。

（2）借助葡聚糖與Con A 的分子識別作用，調節Con A 和葡聚糖納米凝膠的質量比可以制備不同尺寸的高層級自組裝體。

（3）游離的Con A 對A549 細胞具有抑制作用，且Con A 在參與高層級自組裝的過程中其生物活性保持不變。