結核性腦膜炎診斷方法研究進展

王樂樂 郭建瓊 楊松 唐神結

結核性腦膜炎(tuberculous meningitis，TBM)是最常見的中樞神經系統結核病類型[1]，也是肺外結核最嚴重的形式，約占全球結核病發病數的1%[2]，占我國肺外結核發病數的7.23%[3]，但不同地區診治現狀差異較大。TBM常以非特異性癥狀起病，急緩、輕重不一，雖腦脊液(cerebrospinal fluid，CSF)指標變化明顯，且多伴局灶性神經系統癥狀體征[4]，但不具有特異性，不能僅依靠臨床癥狀和影像學表現確診。并且，由于實驗室檢測技術對TBM檢測敏感度低、耗時長，導致患者通常早期即接受經驗性治療，易致治療延誤，死亡率高達30%～40%，神經性致殘率高達50%，甚至終生殘疾[5-7]。筆者擬對TBM的實驗室診斷、組織病理學診斷、影像學診斷等方法的研究進展進行綜述，以供臨床醫師參考。

一、TBM診斷存在的問題

傳統的TBM診斷策略是根據結核病的發病率、流行病學、體格檢查、血液和CSF分析等進行疑似TBM診斷[8]。但其臨床特征及傳統實驗室檢測方法存在諸多問題。

TBM是結核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis，MTB)侵犯蛛網膜下間隙導致的亞急性或慢性腦膜炎癥，不具有典型臨床表現，易與其他形式的中樞神經系統結核病相混淆，如結核瘤和結核性腦膿腫[9]；尤其是老年TBM患者，通常需結合既往病史、實驗室檢測及診斷性抗結核治療有效而確診。葛向華等[10]分析了3例不典型TBM患者，發現其起病初期均無神經系統受累表現，僅出現不明原因發熱，血常規均正常，結核菌素皮膚試驗和CSF抗酸染色均陰性，抗感染治療也無效，頸腰椎穿刺提示顱壓高，CSF中葡萄糖和氯化物降低、蛋白增加，但其改變也不典型，經診斷性抗結核治療有效而確診。

目前，尚缺乏高敏感度和高特異度的單一診斷TBM的檢測技術。傳統的TBM檢測方法包括抗酸桿菌涂片鏡檢和分枝桿菌培養。涂片鏡檢雖耗時短、應用廣泛，但敏感度僅為10%～15%[11-12]。MTB培養雖更敏感(50%～60%)，但耗時長，難以滿足臨床及時性的需求[12-14]；又由于CSF中的MTB載量較低，且培養前的經驗性治療更進一步降低了MTB載量，常難以檢出或呈現假陰性，加之標本獲取困難，尤其是兒童患者，這些均是目前TBM診斷困難的重要原因[15-17]。

二、TBM實驗室檢測

目前，常用的實驗室檢測方法包括分枝桿菌萋-尼抗酸染色鏡檢、BACTEC MGIT 960(簡稱“MGIT 960”)培養、生化診斷、免疫學診斷、核酸擴增技術、基因測序技術。《2019中國中樞神經系統結核病診療指南》對于疑似中樞神經系統結核病患者，推薦行CSF的MTB快速核酸檢測[如超敏利福平耐藥基因檢測(GeneXpert MTB/RIF Ultra，簡稱“Xpert Ultra”)、環介導等溫擴增試驗(loop mediated isothermal amplification assay，LAMP)等]、抗酸桿菌涂片鏡檢及MGIT 960培養；對于不能明確診斷的患者，可行多次檢查以提高陽性率(強烈推薦)；當CSF送檢MTB病原學標本量不足時，可優先送快速核酸檢測(推薦)[4]。這提示傳統的分枝桿菌萋-尼抗酸染色鏡檢和核酸擴增技術(如Xpert 和Xpert Ultra)均可用于TBM的快速診斷[8]。目前，在改良萋-尼抗酸染色鏡檢、脂阿拉伯甘露聚糖(lipoarabinomannan，LAM)抗原檢測和Xpert Ultra檢測方面均有較新進展。

(一)MGIT 960培養

MGIT 960培養仍然是確診TBM的金標準[18-19]。Krishnakumariamma等[20]發現，以MGIT 960培養結果為參照標準，Xpert檢測CSF標本中MTB的敏感度和特異度分別為72.7%和98.5%，且MGIT 960檢出的3株耐異煙肼(INH)的MTB中有2株經線性探針檢測(line probe assay，LPA)顯示對INH耐藥，1株耐多藥菌株經Xpert檢測為利福平耐藥假陰性。因此，Xpert檢測陰性樣本仍應進行MGIT 960培養以排除TBM。

(二)改良萋-尼抗酸染色鏡檢

改良萋-尼抗酸染色鏡檢CSF在結合患者臨床癥狀、CSF細胞組成、生化結果和微生物檢測的基礎上可臨床診斷TBM及提供TBM免疫監測，有助于早期診斷、最佳治療和改善預后[21]。但目前的研究結果尚存在較大差異。如2014年我國報道傳統和改良萋-尼抗酸染色鏡檢對TBM的檢測敏感度為3.3%和82.9%[22]，但Heemskerk等[23]在一項大型前瞻性、國際多中心研究中發現，傳統和改良萋-尼抗酸染色鏡檢檢測CSF標本用于診斷TBM的敏感度分別為33.9%和34.5%，差異無統計學意義。因此，尚不能明確改良萋-尼抗酸染色鏡檢是否存在優勢，但可在檢測敏感度更佳的診斷方法出現前，充分利用現有檢測手段，通過擴大CSF的檢測量來優化檢測結果。

(三)生化診斷

腺苷脫氨酶(adenosine deaminase，ADA)在機體組織中(主要在胸腺、脾和其他淋巴組織)分布廣泛，在血液中(紅細胞和T淋巴細胞)含量豐富[24]。對CSF-ADA的活性檢測是一種簡單、快速和穩定的方法，可用于早期鑒別TBM和其他原因的腦膜炎，利于及時治療和改善預后。

TBM患者CSF-ADA水平隨有效抗結核治療時間的延長而明顯降低，且呈動態變化，有助于評價抗結核治療的效果及判斷患者病情變化。陳顏強等[25]依據英國醫學研究委員會對TBM的分期標準發現，Ⅲ期患者的CSF-ADA水平明顯高于Ⅰ期患者(P<0.05)，且隨著治療時間的延長CSF-ADA 水平逐漸降低，與史君華等[26]研究結果一致。另外，Chan等[19]研究顯示，TBM患者的CSF-ADA活性水平[(8.6±2.1) IU/L]明顯高于非TBM患者[(2.8±5.9) IU/L]，在最佳診斷截斷值為5.1 IU/L時的敏感度和特異度分別為100%和91%，但目前診斷臨界值仍存在爭議。

(四)免疫學診斷

外周血結核感染T細胞斑點試驗(T-SPOT.TB)可測定MTB在特異性抗原刺激下外周血γ-干擾素(IFN-γ)釋放效應T細胞的數量[27]。該試驗可及時捕獲細胞因子，排除免疫狀態和卡介苗接種的影響，敏感度和特異度均較高[28]，已成為診斷TBM的可靠輔助參考指標之一。

張新寶等[27]研究顯示，外周血T-SPOT.TB診斷TBM的敏感度為82.3%，明顯高于檢測CSF-ADA(61.3%)、MTB-DNA(27.4%)和抗酸桿菌涂片鏡檢(16.1%)，差異均有統計學意義(P值均<0.01)；且4種檢測方法的受試者工作特征(ROC)曲線下面積(AUC)分別為0.815、0.661、0.637、0.581，提示外周血T-SPOT.TB診斷TBM的效能最高。王鑫和買爾旦·阿不來[29]研究發現，T-SPOT.TB與IFN-γ聯合檢測的敏感度、特異度、陰性預測值、陽性預測值均明顯高于T-SPOT.TB和IFN-γ單項檢測(P值均<0.05)；且TBM患者的CSF均呈“混合淋巴細胞反應”，與化膿性(中性粒細胞為主)和病毒性腦膜炎(淋巴樣細胞反應)患者明顯不同，有助于鑒別診斷。陳宇和姚素艷[30]研究發現，Xpert和T-SPOT.TB聯合檢測CSF標本診斷TBM的陽性率均明顯高于非TBM的結核病患者，且兩種方法并聯診斷TBM的敏感度最高(78.57%)，準確度達71.00%；而兩種方法串聯及Xpert單獨檢測TBM的特異度均高達100.00%，無誤診。

(五)核酸擴增(nucleic acid amplification test，NAAT)技術

1.數字聚合酶鏈反應(digital PCR，dPCR)：是通過定量檢測CSF中MTB插入序列IS6110來提高對TBM的診斷能力，是快速和敏感的分子檢測方法。Li等[31]研究發現，IS6110-dPCR法的敏感度[57.4%(95%CI：44.8%～69.3%)]明顯高于旋轉酶B亞基(gyrase subunit B，gyrB)-dPCR法[22.1%(95%CI：12.9%～33.8%)](P<0.05)，但特異度 [分別為97.0%(95%CI：84.2%～99.9%)、100.0%(95%CI：89.4%～100.0%)]差異無統計學意義。IS6110-dPCR的敏感度也明顯高于CSF涂片鏡檢(6.7%)、MTB培養(12.5%)、IS6110定量PCR(quantitative PCR，qPCR；21.9%)和Xpert(29.6%)，差異均有統計學意義(P值均<0.05)。

2.Xpert、Xpert Ultra、LAM與LPA：Xpert和Xpert Ultra 均是WHO推薦的快速分子檢測技術[32]。Xpert檢測操作簡單，可在2 h內獲得結果，已在全球廣泛應用。以MGIT 960液體培養為參照標準，Xpert檢測CSF標本用于診斷TBM的敏感度和特異度分別為72.7%和98.5%，具有高特異度、中等敏感度和快速診斷特點，可作為早期診斷TBM的方法，在分子診斷中具有重要地位[33]，但由于其陰性預測值為84%，故建議對陰性樣本進一步行MGIT 960培養或LPA以排除TBM[12,20]。Kay等[32]的系統綜述發現，Xpert檢測<15歲TBM患兒CSF的敏感度和特異度分別為54.0%(95%CI：27.8%～78.2%)和93.8%(95%CI：84.5%～97.6%)，但納入研究的可信度較低，對于疑似TBM患兒，治療方法和療程應基于所有的臨床信息，不應僅依靠Xpert檢測結果。

Xpert Ultra彌補了Xpert在結核病診斷方面的局限性，提高了診斷的敏感度和可靠性。其體外檢測下限由Xpert的100～120菌落形成單位(CFU)/ml下降至約16 CFU/ml，與MTB培養相似(約10 CFU/ml)[34]。雖然Xpert Ultra陰性結果亦不能排除TBM，但與其他實驗室診斷方法比較，Xpert和Xpert Ultra仍對TBM具有較高的診斷價值，特別是Xpert Ultra可使TBM的確診率從36%增加到51%，已被推薦為診斷TBM的首選檢測技術[31]，可替代Xpert檢測[35]。Bahr等[13]研究表明，Xpert Ultra診斷HIV感染與疑似TBM共病患者的敏感度為95%，確診TBM的敏感度為95.5%(95%CI：77%～99%)，高于Xpert[45%(95%CI：24%～68%)]和MTB培養[45%(95%CI：24%～68%)]；Xpert Ultra、Xpert和MTB培養對可能和高度疑似TBM患者的診斷敏感度分別為70%(95%CI：47%～87%)、43%(95%CI：23%～66%)和43%(95%CI：23%～66%)。Huang等[36]發現，Xpert Ultra、Xpert和MTB培養診斷TBM的特異度均為100%，均可準確診斷耐藥患者，且Xpert Ultra診斷TBM的敏感度(45%)明顯高于Xpert(28%)和MTB培養(18%)。

以CSF中MTB培養陽性為參照標準，LAM抗原檢測診斷TBM的敏感度僅為21.9%[37]。對可能和高度疑似TBM患者的CSF行新型即時護理尿脂阿拉伯甘露聚糖試驗(Fujifilm SILVAMP TB LAM，FujiLAM)的檢測敏感度為52%，特異度為98%[38]，與Xpert Ultra檢測的敏感度(55%)接近，而Alere Determine TB LAM Ag (簡稱“Alere LAM”)檢測的敏感度僅為14%。故在Xpert Ultra不可行的情況下可使用FujiLAM替代[38]。

Xpert Ultra和LAM檢測方法使診斷TBM進入了快速診斷和早期治療的新時代，但Xpert Ultra不能作為診斷TBM的單一診斷方法，應謹慎據此排除TBM。基于目前診斷方法的局限性，聯合患者臨床癥狀、影像學特征和其他實驗室指標等多種方法對診斷TBM仍非常必要[2,39]。

(六)測序技術

1.二代測序(next generation sequencing，NGS)：CSF-NGS 可用于常規篩查MTB陰性患者，以提高病原學檢出率[4]，且在CSF常規檢查結果不典型的情況下，有助于早期精準診斷TBM。錢喬喬等[40]對5例TBM患兒行CSF-NGS 檢查得到MTB序列，但有2例最初常規檢查中為假陰性。林愛清等[41]以傳統診斷方法為參照標準，發現CSF-NGS對CSF 分枝桿菌涂片、培養及MTB核酸PCR檢測等傳統檢測陰性患者的檢測敏感度為63.6%；以臨床診斷為參照標準，CSF-NGS和傳統檢測方法檢測的敏感度分別為58.8%和29.4%，特異度均為100%，但與Xpert差異無統計學意義。Yu等[42]系統分析了宏基因組CSF-NGS對TBM的診斷價值，結果顯示其診斷TBM的敏感度為27%～84%，特異度為96%～100%，AUC提示診斷效果良好，可作為TBM的早期診斷方法，但各研究異質性差異明顯，故應謹慎根據宏基因組NGS檢測結果進行診治，但其對亞急性和慢性腦膜炎的診斷仍具有非常好的應用前景[15]。另外，NGS存在以下局限：首先，NGS雖能準確檢測病原體DNA類型，但對病原體RNA類型仍需進一步探索；其次，NGS的檢測費用目前仍相對較高，限制其臨床使用；再次，NGS無法確定MTB是否耐藥，無法檢測耐藥菌株。

2.焦磷酸測序：是第一代基因型檢測方法，可以在6 h內檢測出MTB突變，直接診斷TBM，并可提供廣泛耐藥突變信息，有助于早期確定治療決策。Ajbani等[43]研究顯示，焦磷酸測序檢測CSF診斷TBM的敏感度 [98.11%(95%CI：89.93%～99.95%)]明顯高于Xpert和MGIT 960培養[分別為43.39%(95%CI：29.83%～57.72%)和61.04%(95%CI：55.31%～66.48%)]，差異均有統計學意義(P值均<0.01)，且焦磷酸測序的耐藥檢測結果與表型藥物敏感性試驗和Xpert耐藥檢測結果的符合率分別為91.30%和95.45%。

三、TBM的影像學診斷

中樞神經系統結核病最常見類型為TBM，其主要影像學特征為基底池腦膜強化、腦梗塞、腦積液和結核瘤，可單獨或聯合發生，顱底腦膜強化伴或不伴結核瘤是TBM最常見且特異性較高的征象。神經系統影像學檢查對中樞神經系統結核病的診斷發揮了重要作用[44]。《2019中國中樞神經系統結核病診療指南》[4]推薦在治療前及治療后48 h對疑似中樞神經系統結核病患者進行頭顱MRI增強或CT增強掃描，以診斷疾病、評估手術適應證和監測治療應答；強烈推薦行胸部CT及其他部位的影像學檢查以查找神經系統外的可疑活動性結核病灶，以作為臨床診斷依據或進一步病原學診斷的采樣部位。

四、TBM的輔助診斷

1.病理診斷：TBM患者中樞神經系統可發生多種病理性改變，包括炎性滲出、肉芽腫性病變、閉塞性血管炎、結核瘤或膿腫等[45]。其中，77%的TBM患者發生腦動脈炎，61.8%血管異常改變的TBM患者會出現腦梗塞及腦積液[46-47]。Sharifi等[48]報道了全球首例卡介苗接種后誘發腦結核瘤的患兒，該患兒在出生6個月時出現惡心、嘔吐、納差和昏迷，顱腦MRI發現松果體內一巨大團塊及腦積液，外科手術取病理組織行PCR，確定為牛分枝桿菌感染，抗結核治療效果較好。故對有卡介苗接種史的嬰幼兒應警惕腦結核瘤的出現。另有報道18例誤診為垂體腺瘤的患者(僅有1例影像學檢查結果為疑似結核瘤)，其中5例患者存在泛垂體功能低下征，3例催乳素水平升高；6例蝶鞍及蝶竇均受累；1例患者的病灶從鞍座延伸至斜坡；3例有肺結核病史。患者臨床癥狀持續15 d至2年，最常見癥狀為頭痛、視力下降或失明，組織病理學檢查均顯示病灶由垂體腺瘤和結核瘤組成，診斷為鞍內結核瘤。這提示當影像學顯示副鼻竇和垂體窩受累及垂體增厚且同時發生斜坡(由顱骨的枕大孔向上至背鞍)時也應懷疑TBM，并建議進一步行組織病理學檢查[49]。

2.臨床診斷：《2019中國中樞神經系統結核病診療指南》推薦在缺乏病原學診斷依據的情況下，應綜合臨床表現、CFS表現、影像學表現和其他部位結核的臨床診斷評分進行中樞神經系統結核病臨床診斷，其中評分≥12分或≥10分(無法進行影像學檢查時)為高度疑似，評分在6～11分或6～9分(無法進行影像學檢查時)為疑似患者(推薦強度低)[4]。

TBM臨床癥狀及體征表現多樣，多以亞急性起病為主，且顱神經損傷、頭痛、意識障礙、頸項強直、克氏征(Kernig征)、布氏征(Brudzinski征)、巴賓斯基征(Babinski征)等不典型表現[45]的發生率均較高，但精神癥狀、癲癇發作的發生率均低于病毒性腦膜炎患者[50]。因此，臨床診療應綜合臨床癥狀、影像學特征、血清免疫學指標、血生化檢測結果、CSF涂片和培養、組織病理和抗結核治療反應等表現[30]，CSF細胞外觀、ADA活性、乳酸脫氫酶、隱球菌抗原水平等也可作為重要鑒別參數[11]。

五、總結

目前，TBM的診斷仍基于傳統的臨床表現、影像學和實驗室檢查等進行評估，并對病原學不明確的TBM采用二代測序鑒定。雖然TBM的診斷研究在不斷發展，Xpert Ultra診斷TBM的準確度和敏感度也獲得了進一步提高，但Xpert Ultra檢測陰性仍不能完全排除TBM。為進一步提高確診率，目前的研究建議：(1)若出現腦膜炎癥狀超過5 d，出現局灶性神經功能缺損，應懷疑TBM[51]。(2)胸部X線攝影顯示粟粒性結核病或肺結核，腦部X線攝影顯示腦梗塞、基底腦膜強化或腦積液，應懷疑TBM。(3)重點采集CSF和增加CSF采集量(>6 ml)，最大化檢測樣本中的MTB菌量，經3000×g離心15 min可提高診斷敏感度[12]。(4)如果CSF檢測失敗，應對其他可能涉及的部位進行診斷性檢測，以尋找病原學證據。如痰液Xpert或尿液TB-LAM檢測[39]。(5)當CSF表現為以淋巴細胞為主、低血糖、高蛋白等特點時，通常見于TBM，但應注意排除免疫抑制患者隱球菌性腦膜炎的可能[52]。(6)對常規抗生素治療無效或診斷不明確的患者可在48～72 h后行重復腰椎穿刺，可能對提高確診率具有一定的臨床應用價值[39]。

2021年1月，世界衛生組織發布的NAAT檢測結核病和耐藥結核病的快速通訊表明：通過低、中、高復雜度自動化NAAT檢測痰標本、呼吸道樣本和MTB菌株對不同藥物的耐藥性是高度準確的[53]。但目前尚無以CSF為樣本行上述三類NAAT的研究，宿主生物標志物和CSF抗原檢測可能在TBM診斷中具有一定的發展前景。