重癥肌無力血清相關抗體致病機制研究進展

王 培， 梁文昭綜述， 徐忠信審校

重癥肌無力(myasthenia gravis，MG)是一種由自身抗體介導的破壞神經肌肉接頭(neuromuscular junction，NMJ)信號傳遞的自身免疫性疾病，以骨骼肌無力和易疲勞為主要臨床表現[1，2]。研究發現抗AchR-Ab、MUSK-Ab等其他針對胞內、胞外抗原的抗體通過一系列不同的機制，參與了MG致病的過程。血清抗體對MG的臨床診斷、治療、管理及預后的評估都具有重要意義，本文對MG相關抗體的形態結構、致病機制、臨床意義相關進展綜述如下。

1 NMJ的結構及功能

NMJ是由運動神經末梢和肌纖維特化形成的突觸結構，包括突觸前膜、突觸間隙、突觸后膜。突觸前膜軸漿內含充滿乙酰膽堿分子(Ach)的突觸小泡。突觸后膜由肌細胞表面特殊分化的終板構成，分布著AchR、離子通道及與細胞骨架相關蛋白如rapsyn，utrophin和dystrophin等[3]。突觸間隙內充滿細胞外基質，內含可將乙酰膽堿水解為乙酸和膽堿的乙酰膽堿酯酶(AchE)。從神經纖維傳來的信號通過NMJ以“電-化學-電信號”的模式傳遞給肌纖維。神經運動纖維產生電信號，使Ach出胞釋放至突觸間隙，并與突觸后膜AchR結合，離子通道開放后肌膜去極化產生終板電位，誘發Ca2+從肌漿網釋放，通過興奮-收縮偶聯機制使肌纖維收縮(見圖1)。AchR以團簇的形式聚集在突觸后膜肌纖維終板上，局部AchR密度增大可以增強信號傳遞[4]。其中Agrin-LRP4-MUSK信號通路誘導的AchR簇集是維持NMJ信號傳導的關鍵因素，所有靶點的損傷都可能破壞NMJ的結構或功能，導致神經-肌肉傳遞障礙[1]。

MUSK、agrin、LRP4是構成NMJ必不可少的部分(見圖1)。有研究提出神經肌肉接頭形成的過程中，在運動神經元軸突分支到達、支配肌纖維之前，MUSK激活誘導肌纖維“預排”(pre-patterning)，在肌管中央有彌漫分布、不穩定的“初始”的AchR簇。Agrin穩定早期的AchR簇，錨定在基板上并與LRP4結合，誘導MUSK的二聚和自激活，進而誘導突觸前和突觸后的分化。運動神經支配后，MUSK的表達下調，并特定固定在突觸后膜發揮作用。在神經肌肉接頭發育成熟的過程中，NMJ增大、形態及分子組成改變，例如原始的AchR逐漸成熟(AchR的γ亞基由ε亞基替代)，突觸后膜特化，成熟的AchR以簇集的形式聚集在肌纖維終板上實現傳導[5，6]。還有很多蛋白及分子參與、調控該過程，如Rapsyn蛋白(receptor-associated protein of the synapse)作為一種自聚合的結構蛋白，通過微管微絲交聯因子1 (microtubule actin cross-linking factor 1，MACF1)的介導，將AChRs與肌動蛋白(actin)細胞骨架錨定，形成成熟的簇固定到突觸后膜終板。熱休克蛋白分子伴侶Tid1s(tumorous imaginal discs1)和Rapsyn固定突觸后膜AchR簇，Tid1s還促進 DOK7-MUSK信號通路(MUSK激活過程)。此外，Wnt-MUSK(CRD)、LRP4、肌肉源性的層粘連蛋白α4、α5和β2還可通過肌肉-神經逆行通路調節突觸前膜的功能[7，8]。

2 MG相關抗體

MG是自身抗體介導的神經系統疾病，根據抗原定位，可將抗體分為抗胞外(跨膜)抗原的抗體和抗胞內抗原的抗體兩大類。所有參與NMJ信號傳遞環節的抗體均可能影響疾病。胞外(跨膜)抗體包括AchR-Ab、MUSK-Ab、LRP4-Ab、agrin-Ab、ColQ-Ab、kv1.4-Ab，胞外(跨膜)抗體主要通過直接或間接影響神經肌肉接頭AchR功能而致病?？拱麅瓤乖目贵w包括titin-Ab、RyR-Ab、Cortactin-Ab，目前暫無確切的胞內抗體致病的直接證據，但胞內抗體提示可能合并胸腺瘤、心臟受累、病情較重[1]，具體機制有待進一步研究。

2.1 抗乙酰膽堿受體抗體(AchR-Ab) AchR是NMJ突觸后膜上的跨膜糖蛋白，AchR的5個亞基中間形成離子通道[9]。突觸前膜合成并以量子的形式釋放Ach，與突觸后膜上的AchR結合，使離子通道開放鈉離子內流、鉀離子外流，肌膜去極化產生微小終板電位(mEPP)，mEPP逐漸累積產生EPP，當EPP峰值達到閾值時誘發肌纖維產生動作電位，引起肌纖維收縮[4]。

AchR-Ab主要致病機制現階段認為主要有以下幾方面：(1)補體激活；AChR-Ab與抗原結合激活補體，膜攻擊復合物(MAC)的形成，最終導致細胞膜溶解、突觸后結構被破壞如終板皺褶簡化、AchR減少、突觸內碎片等，并且動物實驗發現補體激活是AchR-Ab病理機制的主要原因[5]。(2)抗原調節：AchR-Ab與AchR交聯(crosslink)，加速突觸后膜AchR內化和破壞，使突觸后膜AchR減少。(3)部分抗體直接阻斷Ach結合位點，破壞傳導通路(見圖1)[1，5]。AchR-Ab按照作用機制分為結合抗體、阻斷抗體和調節抗體，相較另外兩種抗體結合抗體有診斷價值[10，11]。

2.2 抗肌肉特異性酪氨酸激酶抗體(MUSK-Ab) MUSK是突觸后膜表達的一種跨膜蛋白，MUSK細胞外區域包含三個Ig結構域(Ig1/2/3)和一個富含半胱氨酸的結構域(cysteine-rich domain，CRD)，胞質結構域包含酪氨酸激酶結構域、短的近膜區和由8個氨基酸構成的的羧基端序列[5，12]。MUSK Ig1結構域與LRP4結合，agrin從神經末梢釋放后與LRP4結合，agrin與LRP4的結合也能促進MUSK-LRP4作用。Agrin-LPR4復合物與MUSK的相互作用引發了MUSK的磷酸化和活化，激活的MUSK促進突觸后膜AchRs的簇集、維持突觸后膜的結構及功能[1，3]。為了維持MUSK的活化和刺激下游通路，DOK7作為肌肉細胞內的銜接蛋白，與MUSK的胞內結構域作用。除agrin-LRP4-MUSK-DOK7信號通路促進MUSK激活、AchR簇集外，Wnt-MUSK(CRD)在NMJ早期神經支配前也促進AchR聚集，即AchR的“預排”(prepatterning)[7，8]。此外MUSK還可通過AchE-ColQ復合物實現AchE在突觸后膜的錨定(見ColQ部分)。

MUSK-Ab主要是IgG4型，與AchR-Ab作用機制不同(兩種抗體Fc域不同)，目前研究認為，MUSK-Ab不直接激活補體也不參與抗原調節，而是通過作用于MUSK與LRP4、ColQ等蛋白的結合位點(MUSKIg1、CRD結構域)，抑制了 MUSK激活，阻斷agrin-LRP4-MUSK信號傳遞，使突觸后膜AchRs密度減低，NMJ處傳導減少致骨骼肌無力和易疲勞[1，7]。還有一小部分抗體是IgG1-3型，MUSK-Ab IgG1-3也能減少C2C12肌管中AchR的簇集，但并不阻斷LRP4-MUSK間相互作用[5，13]。也有研究顯示，MUSK-Ab通過阻止MUSK與ColQ結合，導致AchE催化活性降低，是另一個可能的致病機制，并認為這也可能是MUSK-MG對ACEI類藥物抵抗的原因[7]。MUSK-MG病情普遍較重，且與抗體滴度相關[1]。

2.3 抗低密度脂蛋白受體相關蛋白4抗體(LRP4-Ab) LRP4是一種跨膜蛋白，其胞外結構域較大包含9個低密度脂蛋白(LDL)的結構域、2個表皮生長因子(EGF)樣結構域和4個β-螺旋結構域。胞內結構域較小，包括1個NPXY模序和與PDZ相作用的C端。LRP4第1個β-螺旋結構域與agrin結合，第3個β-螺旋結構域與MUSK第1個Ig結構域結合，第3個β-螺旋結構域的邊緣部分調節MUSK信號以及中心部分調節Wnt信號[3，5，8，14]。LRP4與agrin、MUSK形成六分子復合物在神經肌肉接頭傳遞信號[3]。

LRP4-Ab參與MG的可能機制現階段研究主要考慮以下幾個方面：(1)LRP4-Ab通過直接與位點相作用或者間接作用于遠端位點改變細胞外的結構域，進而干擾MUSK-LRP4、agrin-LRP4的相互作用。有研究發現LRP4-MG患者血清破壞了LRP4-agrin作用[15]。(2)LRP4-Ab也可能通過交聯，誘導LRP4內化，細胞表面的LRP4減少。(3)LRP4-Ab也可能通過補體激活損傷NMJ，目前已經在動物實驗中得到驗證[3]。

2.4 抗集聚蛋白抗體(Agrin-Ab) Agrin是一種由運動神經末梢釋放的硫酸乙酰肝素蛋白聚糖(HSPG)。agrin N端包含9個卵泡抑素樣的重復序列，中心包含兩個層粘連蛋白B樣結構域，C端包含3個層粘連蛋白G樣(LG)結構域、4個EGF樣結構域。N端結構對agrin固定在NMJ是必需的，其C端(LG3結構域)的B/Z剪接位點中插入8個氨基酸形成的B/Z結構區(即Z8)與LRP4構成二聚體，這對突觸后膜AchR的聚集起重要作用[1，3，5，16]。agrin 與肌纖維膜上的蛋白結合(如LRP4、肌營養不良蛋白聚糖、層粘連蛋白)，調節NMJ的形成、維持和再生[1]。Agrin與LRP4結合是NMJ中agrin-LRP4-MUSK信號傳遞通路的重要環節，同時agrin還能促進MUSK與LRP4間的相互作用[3]。

動物模型主動免疫agrin致病已得到證實，有研究發現MG患者血清能抑制C2C12肌管中agrin介導的MUSK磷酸化，提示LRP4-agrin間相互作用受阻。Agrin-Ab作用機制考慮為agrin-Ab阻止agrin與LRP4結合，NMJ信號傳遞受損，抑制MUSK磷酸化和AchR的簇集[1，5]。

2.5 抗ColQ抗體(ColQ-Ab) 膠原蛋白(Collagen)構成細胞外基質的骨架，是突觸間隙中突觸基底結構的組成成分。ColQ是AchE瞄定和聚集在NMJ環節中至關重要的蛋白，ColQ瞄定、結合細胞外基質的AchE，并被固定在突觸基底膜上。ColQ的每一條鏈都能與AchE的四聚體結合，NMJ中主要是A12型，由12個AchE亞基和3個ColQ組成[17]。ColQ的N端包含8個脯氨酸(PRAD)，N端結構域通過催化亞基與AchE相作用，中央膠原結構域的兩個肝素結合位點介導與perlecan蛋白(一種HSPG)結合，perlecan結合α-dystroglycan，將細胞外基質和細胞骨架相連，C端與MUSK的Ig1和CRD結構域結合，ColQ和MuSK之間的關聯使ColQ-AChE符合突觸定位[8，17，18]。有關ColQ-Ab的病理機制的研究比較有限，ColQ-Ab可能破壞ColQ-AchE復合物濃度，減少突觸間隙AchE的數量[19，20]。有研究發現ColQ功能受損導致Ach在突觸間隙時間延長，終板電流的時間延長、離子流增強，最終導致終板肌病、神經肌肉傳導受損、終板受體敏感性減低[17，19，21]。實驗小鼠缺少ColQ后AChE不再分泌，突觸間隙Ach呈高水平狀態。Sigoillot等發現骨骼肌、肌管ColQ敲除的小鼠，膜結合MUSK和AchR簇集均減少，在ColQ缺乏的肌管中補充ColQ后能部分恢復agrin介導下的AchR簇集[17，22]。但是Otsuka等研究發現，AchE-ColQ復合物能阻滯MUSK與LRP4相互作用，抑制agrin-LRP4-MUSK信號通路。因此ColQ對AchR聚集可能存在兩個相反的作用機制[23]。

2.6 抗kv1.4抗體(kv1.4-Ab) 電壓門控式鉀離子通道是由四個跨膜α-亞基構成的四聚體，kv1.4是分子量大小約為73 KDa的α-亞基，kv1.4控制突觸前膜Ach的釋放[4，24]。Kv1.4主要在中樞神經系統神經元中表達，也存在于外周神經、骨骼肌和心肌中[24]。

有研究發現，Kv1.4-Ab在日本MG患者陽性率為11%～18%，癥狀重，可以合并心肌炎、肌無力危象、胸腺瘤等。而Kv1.4-Ab在高加索人MG患者中陽性率接近(為17%)，但這些患者癥狀相對較輕，多數僅表現為眼肌型[4，25]。這可能與不同種族間遺傳差異相關，例如在高加索人群中DR3與EOMG(發病年齡小于50歲)正相關，與LOMG(發病年齡大于50歲)負相關；DR7反之。而DR3與DR7在日本MG患者中罕見，取而代之的是DR9與DR2，與高加索人群中DR3和DR7有類似的關系[25，26]。

2.7 抗連接素抗體(Titin-Ab) Titin是一種位于骨骼肌和心肌肌小節內的絲狀肌肉蛋白，大小約3000-4200kDA，是分子量最大的肌肉蛋白。但titin-Ab特異性作用于titin 30kDA區域，約占titin大小的1%(即MGT30)，MGT30靠近肌小節 A/I帶交界處，是titin主要的免疫原區[4，27，28]。Titin對骨骼肌收縮起著關鍵作用，titin-Ab可能是通過表位擴展與胞內抗原反應，影響肌肉收縮。在EOMG患者中titin-Ab對提示胸腺瘤的意義較大[27～29]。

2.8 抗蘭尼堿受體抗體(RyR-Ab) 蘭尼堿受體(RyR)是骨骼肌和心肌肌漿網上的Ca2+通道，RyR的四種同源性亞基中間形成一通道。RyR通過介導Ca2+從肌膜釋放到細胞質參與興奮-收縮耦聯機制，肌膜去極化時通道開放，Ca2+從肌膜進入細胞質，激活肌漿中的收縮蛋白、引起肌肉收縮[30，31]。RyR有兩種分型，其中RyR1型與骨骼肌相關，心肌為RyR2型，RyR-Ab能與兩種分型交叉反應[32]。關于RyR-Ab病理機制目前認為RyR-Ab作用于RyR，阻止蘭尼堿(Ryanodine)和RyR的結合，離子通道開放受阻，Ca2+釋放受限[33]。研究發現RyR-Ab可引起RyR功能變構抑制。通過動物實驗發現RyR-Ab在體內直接與RyR結合是肌無力的致病因素[34]。

2.9 抗皮質蛋白抗體(Cortactin-Ab) 皮質蛋白(Cortactin)是一種骨骼肌的胞內微絲肌動蛋白結合蛋白，在NMJ中促進肌動蛋白(actin)的組裝和MUSK介導下的AchR簇集。Cortactin和Arp2/3蛋白復合物均在AchR簇位點富集，cortactin是酪氨酸激酶的底物，Arp2/3蛋白復合物是皮動蛋白的重要靶點，也是細胞內actin聚合的關鍵調節因子[35]。目前認為agrin/MUSK信號通過src(可能還有其他)酪氨酸激酶作用于cortactin，cortactin與Arp2/3復合物(可能還有Nck1、N-WASP等蛋白)共同作用，促進actin在NMJ的聚合和AchR的簇集[8，35]。研究發現酪氨酸磷酸化缺陷的cortactin突變體強制表達后，會抑制agrin誘導的AchRs簇集，通過RNA干擾降低內源性cortactin水平也是如此[35]。

Illa等提出cortactin-Ab的免疫原理可能與抗雙載蛋白抗體(stiff person encephalomyelitis)假說類似，在神經肌肉傳遞過程中，胞內抗原在突觸間隙表面“短暫的兼職”(transient moonlighting)，給自身抗體一個短暫的機會窗口，抗原-抗體可以瞬時特異性結合作用[36，37]。Cortactin-Ab在健康人群和其他疾病中均有發現，如Lambert-Eaton肌無力綜合征，這意味著cortactin可能也在突觸前表達，并作為Wnt信號依賴的突觸前效應分子[8]。Cortactin-Ab可能對血清雙陰性的眼肌型MG患者有著重要診斷價值[36]。

NMJ由突觸前膜、突觸間隙、突觸后膜組成，Ca2+內流誘發Ach出胞從神經末梢釋放至突觸間隙，與突觸后膜AchR結合，離子通道開放，肌肉收縮(圖中黑色箭頭所示)。Agrin從神經末梢釋放，在NMJ形成agrin-LRP4-MUSK信號通路，在Rapsyn蛋白等作用下促使突觸后膜AchR簇集(藍色箭頭及對話框所示)。AchR-Ab激活補體，形成MAC破壞突觸后膜；AchR-Ab與突觸后膜AchR交聯，加快AchR內化及退化；AchR-Ab也可以直接阻斷Ach結合位點(圖中紅色對話框標注)。MUSK-Ab、LRP4-Ab、agrin-Ab作用于agrin-LRP4-MUSK信號通路影響突觸后膜AchR簇集和NMJ。Titin-Ab、RyR-Ab影響肌肉收縮。Cortactin-Ab可能與抗原瞬時結合，抑制突觸后膜AchR聚集。ColQ-Ab可能破壞ColQ-AchE復合物，影響突觸間隙AchE數量。

3 結 論

綜上，重癥肌無力是累及NMJ的自身免疫性疾病，血清抗體檢測是診斷MG的主要方式。AchR-Ab、MUSK-Ab是MG主要致病抗體且致病機制已較為明確，其余抗體的機制有待進一步研究。對于LRP4-Ab、agrin-Ab，已有研究發現實驗動物主動免疫抗原后產生抗體，并與自身抗原反應表現出MG樣癥狀，但還需被動轉移患者血清(抗體)至實驗動物觀察是否出現肌無力癥狀來進一步證實抗體致病[5]。RyR、titin、cortactin是肌肉收縮的重要蛋白，但其細胞內定位使得自身抗體不太可能在MG中發揮直接致病的作用[4]。除上述抗體外，在MG患者血清中還發現有Collagen XIII-Ab、Rapsyn-Ab、AchE-Ab等抗體，但機制不清楚。此外仍有5%～10%的患者血清中未能檢測出已知的抗體(血清抗體陰性)[5]。MG是由免疫等多種因素參與的疾病，血清抗體為MG的診斷、療效、預后等方面提供依據，而MG的相關血清抗體機制的進一步研究有利于MG患者的早期診斷及精準治療。