非結核分枝桿菌的臨床檢測研究進展

潘 晴 暴芳芳 劉 紅 張福仁

山東第一醫科大學附屬皮膚病醫院(山東省皮膚病醫院，山東省皮膚病性病防治研究所)，濟南，250022

分枝桿菌是細菌中重要的一類，屬放線菌目、分枝桿菌科，主要包括結核分枝桿菌復合群(Mycobacterium tuberculosis complex, MTC)、麻風分枝桿菌(Mycobacterium leprae)和非結核分枝桿菌(non-tuberculous mycobarteria, NTM)[1,2]，其可通過多種途徑如皮膚、呼吸道、消化道等進入人體，激活細胞免疫；亦可引起局部的免疫反應(免疫細胞的聚集及相關細胞因子、趨化因子等的釋放)，形成肉芽腫。其中，非結核分枝桿菌(也稱非典型分枝桿菌)在我們周圍的環境中無處不在，包括水、土壤、動物、植物、乳制品和其他食品，目前已鑒定出180多種NTM[3]，主要包括海分枝桿菌、鳥分枝桿菌、胞內分枝桿菌、潰瘍分枝桿菌、龜分枝桿菌、膿腫分枝桿菌等。非典型分枝桿菌易引起肺部及皮膚感染，引發肺部疾病最為常見。自20世紀90年代中期以來，特別是隨著艾滋病的流行、器官移植以及免疫抑制劑應用的增多，非結核分枝桿菌感染患病率不斷上升[4,5]。結核分枝桿菌感染與NTM感染臨床表現相似，臨床醫生易將非結核分枝桿菌疾病誤診為結核分枝桿菌病或者真菌感染如“孢子絲菌病模式”[6,7]，采取了不當的治療手段，對患者病情造成不良影響[8]，因此，對感染菌株進行鑒定對于非結核分枝桿菌感染性疾病的診療至關重要。本文對于非結核分枝桿菌在國內外檢測鑒定的研究現狀做出如下綜述。

非結核分枝桿菌一般分為2類，快生長分枝桿菌(rapid growing non-tuberculous mycobacteria，RGM)和慢生長分枝桿菌(slowly growing non-tuberculous mycobacteria，SGM),在營養豐富、溫度適宜的條件下培養，7天內肉眼可見單個菌落者為快生長菌(RGM)，大于7天者則為慢生長菌(SGM)[9]。目前鑒定方法主要有傳統檢測法、PCR-核酸序列檢測法、qPCR法、PCR-限制性片段長度多態性(PCR-RFLP)分析法、PCR單鏈構象多態性(PCR-SSCP)法、基因芯片法、速生型非結核分枝桿菌快速MIC鑒定法、免疫學鑒定法等。

1 傳統檢測法

雖然，NTM感染與MTC感染臨床表現極為相似，但是NTM感染仍反應出特殊性，若患者合并肺部基礎疾病并伴咯血，肺高分辨CT空洞發生率高，病灶內干酪化較少，鈣化較低，PPD試驗(結核菌素試驗)陰性，以及運用治療結核病方法效果不明顯等癥狀時，則應考慮是否為NTM感染[10]。應立即將患者痰涂片進行抗酸染色，但此方法不能區分麻風分枝桿菌、結核分枝桿菌復合群以及非結核分枝桿菌，若抗酸染色為陽性結果，應再進一步利用培養基進行培養，并分離菌株進行 PNB(對硝基苯甲酸)生長實驗，以此判斷此菌株是快速型(RGM)或緩慢型分枝桿菌(SGM)以及是否為非結核分枝桿菌，并且抗酸染色法存在陽性率不高的缺點[11-13]。Wang等[14]在培養基中加入500 μg/mL的PNB可選擇性抑制MTC，但是NTM菌株具有抗性，通過液相色譜-串聯質譜法(LC/MS/MS)對PNB的還原產物進行鑒定，發現只有NTM菌株可檢測到該產物，以此對MTC、NTM進行鑒別。但是，此法耗時長。

2 PCR-核酸序列檢測法

16S rRNA基因是細菌鑒定最常用的基因，然而，該基因在不同的分枝桿菌物種中具有高度相似的序列，因此無法區分密切相近的非結核分枝桿菌物種。為了克服這些局限性，最近的研究利用其他基因，如hsp65和rpoB來準確鑒定NTM,序列數據分析需利用 GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)公共數據庫[15]。

(1)普通PCR法：M. Saifi等[16]利用hsp65基因測序鑒定了48株分枝桿菌，其中包括32株NTM。Cheng等[17]從奶牛身上采集320份可見病變組織，其中11個樣本顯示典型肉芽腫病變，共培養得到8例菌株，對其進行3個基因(16S rRNA、hsp65和rpoB)測序以鑒別物種。Joao等[18]對22株參考菌株和54株臨床分離株利用16S rRNA、hsp65基因測序進行鑒定，鑒定率與商用試劑盒相比顯著提升。Varahram等[9]對水和土壤標本進行16s-23s rRNA和hsp65基因進行測序，344例RGM中鑒定出322例(94.4%)。

(2)巢式PCR：巢式PCR是一種先利用外部引物擴增基因組中的特異性區域，將細菌鑒定至屬、種水平，再利用內部引物擴增基因組中的特異性區域，將細菌鑒定至種甚至亞種水平的方法[19]。李學淵等[20]利用巢式PCR檢測手部慢性肉芽腫標本37例，有22例非結核分枝桿菌陽性。林愛紅等[21]利用巢式PCR檢測公共場所中水、土壤、風管積塵和氣溶膠樣本中結核分枝桿菌和非結核分枝桿菌，并對陽性率進行分析。

(3)多重PCR：多重PCR是指在同一PCR反應體系中，同時加上多種病原微生物的特異性引物，進行PCR擴增，可用于同時檢測多種病原體。該方法具有高效、低成本、速度快等優點，有較好的可操作性[22]。Kim等[15]分別利用這3個基因(16S rRNA、hsp65和rpoB)對109例臨床菌株測序，物種鑒別率分別為 71.30%、86.79%和81.55%，但使用多重PCR的方法可使物種鑒別率提高到97.25%。Chae等[23]對55株參考菌株和94株分枝桿菌臨床分離株進行多重PCR檢測，檢測結果與標準一致。

3 熒光定量PCR(qPCR)技術

qPCR檢測技術原理是在普通PCR反應體系中加入熒光基團，利用熒光信號積累實時監測整個PCR進程，最后通過標準曲線對未知模板進行定量分析的方法[24]。qPCR產物分析不用打開PCR反應管，可減少核酸實驗室污染風險，對于定性檢測是非常重要的優點，此外該方法還具有準確度高、靈敏、特異性強和檢測快速的優點。Lee等[25]采用實時熒光定量PCR試劑盒(Genetree Research Inc., Seoul, Korea)檢測痰標本、支氣管沖洗和培養標本中MTBC、NTM，敏感性可達98%以上，特異性100%。王旭洲等[26]采用熒光定量PCR技術對200例肉芽腫病變進行分枝桿菌檢測，其中100例結核分枝桿菌陽性，3例非結核分枝桿菌陽性。Rahman等[27]利用LyteStar TB/NTM qPCR試劑盒(Altona Diagnostics，德國)，分析了782例疑似結核患者的臨床標本，檢測出49例MTB、74例NTM陽性樣本。

4 PCR-限制性片段長度多態性(PCR-RFLP)分析法

PCR-RFLP分析法是通過PCR擴增分枝桿菌相對保守的基因片段，根據分枝桿菌保守基因組DNA片段內的限制性酶切位點的不同，將擴增產物經限制性內切酶消化切割成不同大小片段，進行瓊脂糖凝膠電泳分析。此項技術提高了目的DNA含量和相對特異性，而且方法簡便，分型時間短[28]。Davar等[29]采用PCR-RFLP技術對8166例臨床樣本進行鑒定，結果有61例為NTM。Farnia等[30]采用PCR-RFLP技術，利用hsp65基因對分枝桿菌進行分子鑒定，確診了80位NTM感染患者。LI等[31]通過PCR-RFLP技術，利用hsp65、rpoB基因對分型為疑似龜/膿腫分枝桿菌復合群的27例臨床樣本進行鑒定，結果有18例為膿腫分枝桿菌，4例為潰瘍分枝桿菌，剩余5例為其他分枝桿菌。

5 PCR單鏈構象多態性(PCR-SSCP)分析法

PCR-SSCP是利用DNA單鏈構象具有多態性進行基因檢測的一種分析技術，該技術敏感性高、操作簡便，廣泛應用于多種基因突變的檢測和基因多態性分析，近年來，PCR-SSCP技術被大量應用于細菌、分枝桿菌等的分類分型研究中[32]。不同種的DNA單鏈其空間構象不同，在非變性PAGE電泳中的遷移率也不同，最終呈現不同的帶譜，從而達到菌種鑒定的目的[28]。靳曉紅等[33]通過設計兩對引物分別擴增16S rDNA兩條片段，根據SSCP電泳圖譜對98株臨床分離株進行鑒定，結果有93株為結核分枝桿菌復合群，5株非結核分枝桿菌。

6 基因芯片法

基因芯片(genechip)(又稱DNA芯片、生物芯片)的原理是雜交測序，隨著90年代以來基因芯片技術的不斷發展，該技術開始應用到分枝桿菌的檢測中。與傳統方法相比，基因芯片技術具有快速、結果可靠、重復性好、通量高的特點，為分枝桿菌的實驗室診斷開拓新途徑。李曉非等[34]對656例抗酸染色陽性的肺結核患者痰標本采用基因芯片法進行菌種鑒定，檢出21例NTM，與培養法一致。Zhu等[35]基于16S rRNA建立生物芯片檢測系統，對64株參考菌株、296株MTC、243株NTM、138株其他菌落、195份痰標本進行鑒定，結果與DNA測序一致率達100%。常鳳霞[36]選取324例臨床上懷疑分枝桿菌感染患者，采集其尿液、痰液及膿液標本，分別采用基因芯片法、涂片抗酸染色技術進行檢測，結果基因芯片技術陽性率9.57%，高于涂片抗酸染色技術(7.41%)。

7 速生型非結核分枝桿菌快速MIC鑒定法

RGM-NTM快速MIC鑒定法是一種采集疑似患者呼吸道分泌物(痰液、支氣管沖洗液、肺泡灌洗液等)在適當的非結核分枝桿菌培養基中培養，利用其采集標本的耐藥性檢測來診斷非結核分枝桿菌及其種類的方法[37]。陳品儒等[38]采用快速生長分枝桿菌藥敏試驗液基微量稀釋 MIC 法，以添加陽離子的 MH2(Mueller- Hiuton)肉湯為培養基，按照結核病診斷細菌學檢驗規程對202株致病性NTM進行8種藥物敏感性測定。8種藥物包括阿米卡星(AMK)，頭孢西丁(CXT)，環丙沙星(CIP)，克拉霉素(CLA)，多西環素(DCC)，利奈唑胺(LZD)，復方磺胺甲基異惡唑(SMZCO)，妥布霉素(TOB)。結果分離鑒定出龜分枝桿菌128株，膿腫分枝桿菌56株，偶發分枝桿菌9株，龜-膿腫及龜-偶發復合群9株。 我國NTM檢出以速生型非結核分枝桿菌為主，常見菌種主要為龜-膿腫分枝桿菌復合群、偶發分枝桿菌、胞內分枝桿菌、龜分枝桿菌等[39，40]。因此，該方法有較高的臨床診斷價值。

8 免疫學鑒定法

分枝桿菌生長過程中會分泌200多種蛋白，最具特異性的蛋白MPB64(mycobacterial protein from BCG of Rm0. 64 in electrophoresis)，是由結核分枝桿菌分泌到菌體外的，而非結核分枝桿菌則不分泌該蛋白，因此，通過檢測和鑒定 MPB64可以鑒別 MTB 和 NTM。Abe等[41]以20株結核分枝桿菌參考菌株和111株臨床分離菌株為研究對象，采用免疫色譜法(MPB64-ICA)對結核分枝桿菌復合物進行了鑒定，結果只有結核分枝桿菌呈現陽性，然后又對362例痰標本中抗酸桿菌陽性的108例進行鑒定，51例為結核分枝桿菌，其它為NTM。張帆等[42]對89例分枝桿菌培養陽性痰標本，采用膠體金法進行結核分枝桿菌MPB64抗原檢測，結果有25例檢測陰性，確診為NTM，該方法檢測NTM，敏感性為96.9%，特異性為100%。潘愛珍等[43]分別采用MPB64免疫膠體金法和傳統PNB/TCH法對2種分枝桿菌標準菌株和418株臨床分離株進行鑒定，與PCR測序方法相比，結果二者一致率分別為95.93%、87.08%。MPB64免疫膠體金法在分枝桿菌菌種鑒定中，特異度靈敏度較高，方法簡便、快速，適合推廣應用。

9 其他鑒定法

其它檢測方法主要有藥敏學方法、三磷酸腺苷(ATP)發光法、結核T淋巴細胞斑點試驗(T-SPOT. TB)等。藥敏學檢測非結核分枝桿菌是一種檢出率高、檢測結果較為準確的方法，其中鳥分枝桿菌利用藥敏學檢測方法檢出率高[12]。李洪敏等[44]通過新型BACTEC MGIT 960全自動快速分枝桿菌培養鑒定藥敏儀鑒定分枝桿菌，與培養法相比縮短了時間，結核分枝桿菌平均7.2天，非結核分枝桿菌最快僅需1天即可報告結果，該儀器自動化程度高、方法簡便。三磷酸腺苷生物發光法是一種經過簡化的生物化學方法，利用ATP與熒光素-熒光素酶復合物的反應來測定是否存在三磷酸腺苷(ATP)。在PNB培養管中一旦有菌生長則其ATP的含量就會隨之升高，反之其ATP的含量則會降低。劉君等[45]對69例臨床菌株進行鑒定，評估ATP發光法準確率達98.6%(68/69)。T-SPOT．TB是一種γ干擾素釋放試驗(interferon-gamma release assay)，通過檢測外周血中經結核分枝桿菌特異性抗原早期分泌靶向抗原(early secreting antigen target 6．ESAT-6，6 kD)和培養濾過蛋白肽段庫(culture filtrate protein 10，CFP．10，10 kD)刺激后釋放γ干擾素的T淋巴細胞，并據此結果判斷是否感染結核的技術[46]。該技術主要應用于結核分枝桿菌感染的診斷和后續監測，而對于非結核分枝桿菌感染的意義未被充分認可。目前已有報道顯示，海分枝桿菌[46]、胞內分枝桿菌、龜分枝桿菌、偶發分枝桿菌[47]、堪薩斯分枝桿菌、戈登分枝桿菌[48]等多種NTM可導致T-SPOT. TB陽性。

10 小結

綜上所述，NTM大多屬于條件致病菌，在周圍環境中分布范圍廣，容易感染免疫力低下的人群。近年來，NTM感染發病率增高，其危害性也越來越受到重視。NTM感染臨床特征與結核病很相似，容易造成漏檢或誤診，延誤臨床的治療，因此，NTM的檢測與鑒定尤為重要。傳統的檢測方法耗時長，限制了臨床應用，當前，分子生物學技術大力發展，可對非結核分枝桿菌進行快速準確地分析，在NTM菌種鑒定方面展現出獨特的優勢和廣泛的應用前景，但為使檢測結果更可靠，應結合細菌學、免疫學等方法，通過多種技術同時鑒定，充分發揮各方法的優勢，使鑒定結果更加準確，以便更好地輔助早期NTM感染疾病的臨床診療。