他汀類與小檗堿對前蛋白轉化酶枯草溶菌素9作用機制的研究進展

陳 瑤，任 毅，王建紅，楊 靜

前蛋白轉化酶枯草溶菌素9(proprotein convertase subtilisin/kexin 9，PCSK9)是由肝細胞內合成，并且可以分泌至血漿中，經過血液循環回到肝臟后，在肝細胞表面與低密度脂蛋白受體(LDLR)結合，然后將LDLR運送到溶酶體降解，由此肝細胞的LDLR受體數量減少，機體通過LDLR清除膽固醇的作用因此減弱，最終導致血漿中低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)水平升高，從而引起動脈粥樣硬化及心血管疾病，對機體健康產生不利影響。包括臨床上常用的降脂藥物他汀類藥物在內，很多種藥物都會對機體循環PCSK9濃度及肝臟中PCSK9基因的表達水平產生影響，包括正向調控和負向調控，進而對降脂藥物發揮降脂療效產生阻礙或協同功效。PCSK9是與LDLR表達密切相關的調節因子，可以誘導LDLR的降解，不利于LDL-C從血漿中清除，妨礙降脂藥物有效發揮降脂作用。他汀類藥物在降低血漿LDL-C的同時可以上調PCSK9表達，減弱降脂效應，他汀類藥物加大劑量不能進一步降低血脂。小檗堿可以下調PCSK9表達，有利于降脂藥物更好地發揮降脂效應。PCSK9表達主要依賴SREBP-2和HNF1α兩個轉錄因子的調節，可以通過調節兩個轉錄因子表達進而對PCSK9的表達產生影響。本研究主要對PCSK9的功能及他汀類和小檗堿對PCSK9的作用和機制進行綜述。

1 PCSK9的發現

PCSK9是前蛋白轉化酶家族中的成員，與同家族中的其他成員enzymes furin、PC1/3和PACE4等類似，屬于絲氨酸蛋白酶，通過水解同源蛋白底物的肽鍵而激活并發揮作用[1]。PCSK9的發現要從一個家族性高膽固醇血癥(FH)的病例說起[2]。Abifadel等[2]對1個有常染色體顯性遺傳家族性高膽固醇血癥(ADH)的家庭進行了基因檢測，最終鑒定PCSK9基因是與ADH相關的第3個位點，前兩個與ADH關系密切的基因是編碼LDLR和載脂蛋白B(ApoB)的基因，PCSK9基因編碼的蛋白質為神經細胞凋亡調節轉化酶(NARC-1)，在肝臟中高度表達，參與膽固醇穩態的調節。

2 PCSK9與脂代謝

2.1 PCSK9與LDL-C、LDLR 血漿LDL-C主要是通過肝細胞表面的LDLR從血漿中清除，維持血漿膽固醇穩態，進而避免冠心病等心血管疾病的發生。正常情況下，LDL-C與LDLR結合形成復合體，然后內化到網格蛋白有被小窩中，最終在溶酶體中降解，完成LDL-C的清除，而LDLR則重新回到肝細胞膜表面，繼續參加后續生物學活動[3]。但是，當PCSK9與LDLR結合時，可以誘導LDLR在溶酶體被降解，從而阻斷LDLR返回肝細胞膜參與新一輪LDLR的循環，肝細胞表面LDLR密度降低，最終血漿脂質平衡被打破，LDL-C濃度升高[4-5]。PCSK9基因有兩種突變類型，一種為功能獲得性(GOF)突變，另一種為功能喪失性(LOF)突變。GOF突變PCSK9功能增強，導致血漿LDL-C濃度過高，即家族性高膽固醇血癥的其中一種類型，未來過早罹患冠狀動脈粥樣硬化性心臟病等心血管疾病[6]。LOF突變PCSK9功能存在缺陷，多項研究發現，血漿LDL-C水平較無突變的群體明顯降低，而未來發生動脈粥樣硬化性心臟病(ASCVD)的風險也大幅度降低，因而對心血管起到了保護作用[7-10]。

2.2 PCSK9與ApoB ApoB是血漿中負責運輸脂類的一種脂蛋白，主要將脂質從肝內運輸到肝外組織，其成分包含三酰甘油、總膽固醇和極低密度脂蛋白(VLDL)，與動脈粥樣硬化相關，此指標可以預測冠心病的患病風險[11]。PCSK9是通過LDLR間接調節肝臟ApoB脂蛋白攝取和膽固醇代謝，同時也可以調控ApoB脂蛋白在溶酶體的降解[12-13]。因而PCSK9也是血漿ApoB水平調節的關鍵靶點[14]。抑制PCSK9的表達，可以導致血漿ApoB水平下降[15]。

2.3 PCSK9與極低密度脂蛋白受體(VLDLR) VLDLR和載脂蛋白E受體都是LDLR家族的成員之一，也都在小腦中有分布，參與腦發育的早期階段，兩種受體在小鼠大腦皮層和小腦中的表達缺失可導致神經退行性改變[16]。VLDLR在結構上也與LDLR相似，具有高度保留的EGF-A結構域。PCSK9可以通過其EGF-A結構域與VLDLR結合，進而促進肝細胞、成纖維細胞和神經元中VLDLR的降解[17-18]。在體內，內源性PCSK9可以調節脂肪組織中VLDLR蛋白水平，而這種調節完全是通過肝臟分泌到肝外的循環PCSK9實現的。因此，PCSK9在脂肪代謝中起著關鍵作用，它通過促進肝臟LDLR的降解使循環膽固醇濃度維持在高水平，但PCSK9也可能通過調節脂肪組織VLDLR限制內臟脂肪的生成[19]。

PCSK9除了能降解LDLR和VLDLR兩類受體，調節ApoB水平外，還可以對凝集素樣氧化型低密度脂蛋白(oxLDL)受體-1(LOX-1)[20-21]、LDLR相關蛋白1(LRP1)[22]和膽固醇轉運蛋白CD36[23-24]等受體蛋白有調節作用，這些蛋白都或多或少與脂代謝和脂質運輸相關，PCSK9通過調節這些蛋白的表達水平，進而對機體脂代謝和心血管疾病的發病風險產生影響，而且PCSK9對于脂代謝的影響總體上是消極的，不利于機體脂質穩態的維持。

3 PCSK9與轉錄因子

與PCSK9轉錄相關的轉錄因子主要有兩個，其中一個是SREBP家族的兩個亞型之一固醇調節元件結合蛋白2(SREBP-2)，另一個是肝細胞核因子1α(HNF 1α)。PCSK9和LDLR基因的甾醇依賴性調控主要是由SREBP-2轉錄因子介導的[25]。PCSK9和LDLR基因的近端啟動子都含有一種基序為功能甾醇調節元件(SRE)，該元件促使SREBPs對細胞內膽固醇水平的改變做出反應。在細胞內膽固醇缺乏的情況下，膽固醇傳感器(SCAP)能夠將SREBP-2蛋白轉運到高爾基體，在高爾基體中進行蛋白水解而成為功能完善的成熟SREBP-2因子。最終成熟形式的SREBP-2進入細胞核后，與PCSK9和LDLR基因啟動子區的SRE-1序列相互作用，導致兩種蛋白質的轉錄和翻譯水平上調[26-27]。另一個影響PCSK9轉錄的轉錄因子HNF1α，在靈長類動物和嚙齒動物中都有分布，為PCSK9轉錄所必需[25，28]。PCSK9的啟動子區SRE基序附近還包含一個HNF1反應位點，該位點主要與HNF1α結合，而LDLR基因啟動子區沒有該位點，因此，HNF1α可以獨立于LDLR的方式調控PCSK9基因的表達。通過抑制或者刺激HNF1α表達可以對PCSK9表達進行調節，進而影響血漿LDL-C水平[29-30]。

4 PCSK9與他汀類藥物

他汀類藥物是目前臨床最常用的降低血漿總膽固醇的藥物，自應用到臨床以來可以有效改善高脂血癥病人血脂水平，延緩血脂異常給心血管帶來的巨大風險。從調控機制上講，他汀類藥物抑制膽固醇的合成使肝細胞膽固醇濃度降低，促使轉錄因子SREBP-2激活，繼而上調LDLR和PCSK9基因的表達[30-32]。LDLR表達水平提高，可以刺激肝細胞從血漿中攝取LDL-C，使血漿LDL-C水平下降，對機體改善血脂有利。而PCSK9的高表達則會誘導肝臟對LDLR在轉錄后降解，機體對膽固醇清除能力減弱，又會導致LDL-C水平升高。這就是他汀類藥物降脂作用的矛盾之處。此外，他汀類藥物還可刺激HNF1α的表達，導致PCSK9生成量增加[29-30]。

多數臨床研究表明，他汀類藥物可以上調人體循環中的PCSK9水平。Guo等[33]研究表明，小劑量阿托伐他汀(10 mg/d)對PCSK9的短期影響是時間和劑量依賴性的，在給藥后24 h內，PCSK9水平迅速升高。Careskey等[34]觀察到阿托伐他汀(40 mg/d)與基線和安慰劑相比，循環PCSK9水平明顯增加了34%。Welder等[35]觀察到阿托伐他汀(80 mg/d)治療后4周時血清PCSK9迅速增加了47%，并持續16周保持在高水平，阿托伐他汀高劑量并不能使血漿LDL-C進一步降低，證明PCSK9可以阻礙阿托伐他汀降脂療效的進一步發揮。Khera等[36]的臨床研究觀察了煙酸、他汀類藥物和非諾貝特對血脂異常病人循環PCSK9水平的影響，發現阿托伐他汀類藥物80 mg/d可使PCSK9平均增加27%。因此，若能將PCSK9抑制劑與他汀類藥物聯合使用，抑制他汀誘導的PCSK9過表達，可以有效降低血漿LDL-C水平。

5 PCSK9與小檗堿

小檗堿是從中藥黃連中分離得到的一種季銨生物堿，是黃連抗菌作用的主要有效成分。近些年的研究發現，小檗堿還可以有效調節脂代謝，改善機體血脂[37-38]。2004年，Kong等[39]研究發現，小檗堿治療可以明顯降低人類和高脂血癥倉鼠的LDL-C，并且降低LDL-C的機制不同于他汀類藥物，小檗堿同他汀類藥物一樣可以上調LDLR表達，但并不依賴于SREBP-2，而是通過激活細胞外信號調節激酶(ERK)通路發揮效應。Kong等[40]一項包括細胞、動物和臨床3個層面的大型研究發現，小檗堿與辛伐他汀聯用治療可以明顯降低高膽固醇血癥病人和大鼠血清LDL-C、總膽固醇、三酰甘油水平，而且效果明顯優于單獨接受小檗堿、辛伐他汀類藥物治療，單獨應用小檗堿治療的降脂療效優于單獨接受他汀類藥物治療。因此，小檗堿是一種新型的降脂藥物。此后，越來越多的臨床和實驗研究表明，小檗堿可以改善血漿總膽固醇、三酰甘油、LDL-C和高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)，有助于機體維持脂代謝平衡[41-43]。

體內外研究都發現，小檗堿也可以調控PCSK9的表達。Cameron 等[44]以小檗堿處理HepG2細胞的體外研究以及Xiao等[45]對血脂異常C57BL/6小鼠的實驗研究都表明，小檗堿可以下調PCSK9表達進而使LDLR表達增加，從而改善血脂。小檗堿抑制PCSK9表達的機制可能與抑制與之轉錄相關的兩個轉錄因子SREBP-2和HNF1α的表達水平有關，即小檗堿通過下調SREBP-2或HNF 1α的轉錄而使PCSK9水平下調，其中主要是通過抑制HNF1α表達而發揮作用[29，46]。但是Jia等[32]評估小檗堿[400 mg/(kg·d)]治療高脂飲食大鼠6周的效果，結果顯示小檗堿和他汀類藥物相似，都可以通過激活SREBP-2增加高脂飲食大鼠和小鼠PCSK9的表達水平。目前各種研究總體上看，小檗堿可抑制PCSK9表達水平。

6 小結與展望

PCSK9是脂代謝的重要調節因子，是降低血漿LDL-C的有效靶點。自從被發現PCSK9并且明確了其與脂代謝的關系以來，眾多課題組都針對諸多各種降脂藥物對PCSK9的影響和機制進行了研究，通過研究篩選出可以下調PCSK9表達協調降脂藥物降低血漿LDL-C水平，最終為臨床上有心血管風險的高膽固醇血癥病人提供高效安全的降脂方案。

目前臨床上常用他汀類藥物降低高脂血癥病人血脂水平，但由于其可以通過激活SREBP-2上調PCSK9的表達和部分病人不耐受導致病人接受他汀類藥物治療后LDL-C未達標，心血管風險依然存在，聯合抑制PCSK9表達的藥物可以高效改善血脂，進一步降低心血管病發生風險。多數研究報道小檗堿可以抑制SREBP-2或HNF1α的表達進而降低PCSK9的表達水平，有效改善血脂，但是目前該藥的降脂療效和對機體PCSK9表達的影響及相關機制尚缺乏充足的臨床證據。因此，未來仍然需要更多臨床和實驗研究以明確可以安全高效降低血脂的用藥方案。