LncRNA RP11-543N12.1與CDH13在老年阿爾茨海默病病人中的表達及其與炎性因子、認知功能的相關性

林軍華，吳永明，金 梅

阿爾茨海默病(Alzheimer′s disease，AD)是臨床常見的一種退行性疾病，其主要表現為認知障礙及記憶力損害，早期診斷及治療可有效提高病人生活質量[1-3]。因而尋找有效生物標志物診斷AD具有重要意義。長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA，LncRNA)在AD中異常表達，并可能參與AD發生及發展過程[4-5]。有研究表明，長鏈非編碼RNA RP11-543N12.1(long non-coding RNA RP11-543N12.1，LncRNA RP11-543N12.1)在AD細胞模型中表達上調，并可能調控鈣黏蛋白13基因(cadherin 13，CDH13)的表達從而參與AD發生及發展過程[6]。有研究表明，CDH13在神經系統發育過程中表達上調并可參與神經細胞遷移及血管形成過程[7]。本研究主要探討LncRNA RP11-543N12.1與CDH13在老年AD病人中的表達及其與血清炎性因子、認知功能的相關性。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2016年10月—2019年10月聯勤保障部隊廬山康復療養中心收治的120例AD病人為AD組，所有病人均符合美國國立神經病、語言交流障礙和卒中研究所老年性癡呆及相關疾病學會(NINCDS-ADRDA)制定的AD相關診斷標準[8]。AD組120例，男80例，女40例；年齡60～75(68.59±9.65)歲；病程0.5～5.0(2.78±0.65)年。根據總體衰退量表分為輕度AD組(50例)、中度AD(39例)、重度AD(31例)[9]。所有病人均進行簡易精神狀態量表(MMSE)篩查，根據MMSE評分將AD病人分為輕度認知功能障礙組(60例)、中度認知功能障礙組(40例)、重度認知功能障礙組(20例)[10]。排除標準：合并心腦等器官損傷病人；視力、聽力減退病人；合并2型糖尿病病人；自身免疫性疾病病人。選取同期在聯勤保障部隊廬山康復療養中心體檢的健康志愿者70名為對照組，男40名，女30名，年齡60～73(65.32±10.03)歲。AD組與對照組臨床資料比較差異無統計學意義(P>0.05)，具有可比性。本研究獲得聯勤保障部隊廬山康復療養中心倫理委員會批準，所有研究對象均簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 采集血液樣本 采集研究對象空腹肘靜脈血10 mL，置于肝素抗凝管，4 ℃條件下經3 000 r/min轉速離心10 min，分離血清，置于-80 ℃超低溫冰箱內保存。

1.2.2 實時熒光定量聚合酶鏈反應(quantitative real-time PCR，qRT-PCR)檢測RP11-543N12.1、CDH13 mRNA的表達水平 采集Trizol法(美國Invitrogen公司)提取血清中總RNA，應用Nanodrop2000c超微量分光光度計檢測RNA濃度與純度。RP11-543N12.1正向引物5′-TAATGGCTGTGACCTGCGTG-3′，反向引物5′-GTCCTTGGTGCATTTGATTTCTCTG A-3′；CDH13正向引物5′-TCCCTGCAGCATCAAACCAT-3′，反向引物5′-TCGACAAATGGGGACTCACG-3′；U6正向引物5′-GCTTCGGCAGCACATATACT-3′，反向引物5′-GTGCAGGGTCCGAGGT ATTC-3′；GAPDH正向引物5′-AACGGATTTGGTCGTATTG-3′，反向引物5′-GGAAGATGGTGATGGGATT-3′，引物由上海生工生物工程股份有限公司設計合成。參照反轉錄試劑盒說明書將總RNA合成cDNA，以cDNA為模板進行qRT-PCR反應，參照實時熒光定量qRT-PCR試劑盒配置反應體系，反應條件：95 ℃預變性5 min，95 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共40次循環。RP11-543N12.1以甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)為內參，CDH13以U6為內參，采用2-ΔΔCt法計算RP11-543N12.1、CDH13 mRNA的相對表達量。反轉錄試劑盒與實時熒光定量PCR試劑盒均購自北京天根生化科技有限公司。

1.2.3 酶聯免疫吸附試驗(ELISA)檢測血清炎性因子水平 采用ELISA檢測血清白細胞介素6(interleukin-6，IL-6)、白細胞介素8(interleukin-8，IL-8)、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)水平，檢測試劑盒購自上海酶聯生物科技有限公司，嚴格按照試劑盒說明書操作。

1.2.4 認知功能評分 采用Addenbrooke認知評估量表第3版(ACE-Ⅲ)、蒙特利爾認知評估量表(MoCA)、MMSE評分評估病人認知功能[11-12]。

2 結 果

2.1 各組血清RP11-543N12.1與CDH13 mRNA表達比較 與對照組比較，AD組血清RP11-543N12.1、CDH13 mRNA的表達水平明顯升高(P<0.05)；與輕度AD組比較，中度AD組與重度AD組血清RP11-543N12.1、CDH13 mRNA表達水平明顯升高(P<0.05)；與中度AD組比較，重度AD組血清RP11-543N12.1、CDH13 mRNA表達水平明顯升高(P<0.05)。詳見表1。

表1 各組血清RP11-543N12.1與CDH13 mRNA表達量比較(±s)

2.2 AD組與對照組血清炎性因子水平比較 與對照組比較，AD組血清IL-6、IL-8、TNF-α水平明顯升高(P<0.01)。詳見表2。

表2 AD組與對照組血清炎性因子水平比較(±s)

2.3 AD組與對照組認知功能評分比較 與對照組比較，AD組MMSE、ACE-Ⅲ、MoCA評分均明顯降低(P<0.01)。詳見表3。

表3 AD組與對照組認知功能評分比較(±s) 單位：分

2.4 不同認知功能障礙AD病人血清RP11-543N12.1與CDH13 mRNA表達量比較 與輕度認知功能障礙組比較，中度認知功能障礙組與重度認知功能障礙組血清RP11-543N12.1、CDH13 mRNA表達量明顯升高(P<0.05)；與中度認知功能障礙組比較，重度認知功能障礙組血清RP11-543N12.1、CDH13 mRNA表達量明顯升高(P<0.05)。詳見表4。

表4 不同認知功能障礙AD病人血清RP11-543N12.1與CDH13 mRNA表達量比較(±s)

2.5 血清RP11-543N12.1、CDH13與血清炎性因子、認知功能評分的相關性分析 采用Pearson法分析血清RP11-543N12.1、CDH13與血清炎性因子、認知功能評分的相關性，結果顯示，RP11-543N12.1、CDH13與IL-6、IL-8、TNF-α呈正相關(P<0.05)，RP11-543N12.1與MMSE、ACE-Ⅲ、MoCA評分呈負相關(P<0.05)，CDH13與MMSE評分呈負相關(P<0.05)。詳見表5。

表5 血清RP11-543N12.1、CDH13與血清炎性因子、認知功能評分的相關性分析

3 討 論

AD的主要病理學特征為海馬、大腦皮層中突觸與神經元呈漸進性缺失，其主要發病機制為神經細胞外不可溶性的β-淀粉樣蛋白沉積形成老年斑與神經細胞內微管相關Tau蛋白高度磷酸化聚集、神經原纖維纏結。有研究表明，LncRNA可通過競爭性結合miRNA而調控其靶基因表達，還可與蛋白相結合從而參與AD發生及發展過程[13-15]。但LncRNA在AD病人血清中的表達及其臨床意義尚未完全闡明。

本研究結果顯示，AD病人血清RP11-543N12.1與CDH13mRNA的表達水平明顯升高，隨著疾病嚴重程度的增加，AD病人血清RP11-543N12.1與CDH13mRNA的表達水平明顯升高，提示RP11-543N12.1與CDH13mRNA表達量升高可能參與AD發生及發展過程。有研究表明，CDH13在神經元識別及相互作用中發揮重要作用[16]。分析原因可能是RP11-543N12.1水平升高可促進CDH13的表達上調從而造成AD病人神經功能損傷。有研究表明，AD病人腦組織中IL-6、IL-8、TNF-α水平升高，表明AD病人腦組織存在嚴重的炎癥反應[17]。與上述研究結果相似，本研究結果顯示，AD病人血清IL-6、IL-8、TNF-α水平升高，進一步研究顯示RP11-543N12.1、CDH13與IL-6、IL-8、TNF-α呈正相關，提示AD病人出現的神經慢性退行性改變與RP11-543N12.1、CDH13表達量升高有關，其表達量升高可能促進腦內免疫及炎癥反應從而導致神經細胞損傷及細胞凋亡。

本研究結果顯示，AD組MMSE、ACE-Ⅲ、MoCA評分明顯低于對照組，進一步研究顯示RP11-543N12.1與MMSE、ACE-Ⅲ、MoCA評分呈負相關，CDH13與MMSE評分呈負相關，提示RP11-543N12.1、CDH13表達量升高與AD病人認知功能障礙有關。同時本研究根據MMSE評分將AD病人分為輕度認知功能障礙組、中度認知功能障礙組、重度認知功能障礙組，結果顯示不同認知功能障礙病人血清RP11-543N12.1、CDH13表達量升高，且隨著認知功能障礙程度的加重，病人血清RP11-543N12.1、CDH13mRNA表達量升高，提示RP11-543N12.1、CDH13mRNA表達量升高可能參與AD病人認知功能障礙發生過程。

綜上所述，RP11-543N12.1與CDH13mRNA在老年AD病人中的表達量升高，其表達量與炎性因子、認知功能評分密切相關，并可能作為AD診斷及評估疾病進展的重要指標，其表達量升高還可能增加AD病人認知功能障礙的發生風險。