腦卒中干預(yù)途徑：靶向NMDA 受體

孫華利 毛森林 王心悅 王毅飛 付 錦△

1）哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院，黑龍江 哈爾濱150000 2）哈爾濱醫(yī)科大學(xué)，黑龍江 哈爾濱150000

腦卒中是一種突然起病的腦血液循環(huán)障礙性疾病，是導(dǎo)致認(rèn)知障礙、殘疾和死亡的主要原因［1］。腦卒中包括缺血性腦卒中和出血性腦卒中，其中大多數(shù)是缺血性腦卒中，由于腦動(dòng)脈血栓或栓塞堵塞，導(dǎo)致腦部血液循環(huán)障礙，缺血、缺氧所致的局限性腦組織的缺血性壞死或軟化，引起一系列復(fù)雜的病理生理反應(yīng)，其中包括突觸和突觸外谷氨酸的積累，離子通道功能紊亂等，最終導(dǎo)致神經(jīng)元細(xì)胞死亡和缺血性腦損傷。

目前公認(rèn)的治療腦卒中的方法包括靜脈溶栓（包括組織纖溶酶原激活劑、尿激酶等）和動(dòng)脈機(jī)械取栓術(shù)，其目的是使閉塞血管內(nèi)得到再灌注［2-3］。然而再灌注時(shí)可能會(huì)出現(xiàn)腦出血的風(fēng)險(xiǎn)，且由于治療時(shí)間窗有限，這兩種治療方法僅適用于一小部分腦卒中的患者。因此，尋找更安全的治療腦卒中藥物依然是醫(yī)學(xué)上的一大需求。

腦卒中后大腦中的神經(jīng)元死亡是一個(gè)活躍且持續(xù)時(shí)間較長(zhǎng)的過程，了解潛在的死亡信號(hào)機(jī)制可將卒中損害降至最低，目前研究最深入的缺血性細(xì)胞死亡機(jī)制之一是興奮性毒性［4］。谷氨酸作為中樞神經(jīng)系統(tǒng)的主要興奮性神經(jīng)遞質(zhì)，在缺血性腦卒中期間發(fā)揮重要的作用。由于缺乏穩(wěn)定的血液流動(dòng)，大腦缺氧，神經(jīng)元無法維持正常的離子梯度電位，導(dǎo)致大量神經(jīng)遞質(zhì)釋放，特別是谷氨酸鹽［5］，谷氨酸在細(xì)胞外間隙大量積聚，導(dǎo)致突觸后神經(jīng)元谷氨酸受體過度激活，引起神經(jīng)元的損傷。

谷氨酸主要通過結(jié)合兩個(gè)受體揮作用，即離子型和代謝型受體。離子型谷氨酸受體是配體門控離子通道包括N-甲基D-天冬氨酸受體（NMDARs）、α-氨基-3-羥基-5-甲基-4-異惡唑丙酸受體（AMPARs）和紅藻氨酸受體（KAR）。NMDA、AMPA受體通過允許離子（主要是Ca2+離子）進(jìn)入細(xì)胞，介導(dǎo)谷氨酸的快速興奮作用。同時(shí)紅藻氨酸受體通過允許鈉和鉀離子通過細(xì)胞膜來發(fā)揮其功能［6］。在興奮性毒性中過量的谷氨酸釋放會(huì)導(dǎo)致離子型谷氨酸受體的過度激活，從而導(dǎo)致鈣離子的不斷涌入。Ca2+離子的異常內(nèi)流觸發(fā)多種鈣調(diào)節(jié)過程，如蛋白酶、核酸內(nèi)切酶、NO 合成酶的激活、自由基的產(chǎn)生和線粒體膜的破壞［6］等一系列下游促死亡信號(hào)反應(yīng)。在離子型谷氨酸受體家族中，NMDAR 在介導(dǎo)Ca2+離子內(nèi)流方面是最有效的，因此其拮抗劑被廣泛認(rèn)為是潛在的神經(jīng)保護(hù)劑［7］。代謝型谷氨酸受體是G 蛋白偶聯(lián)受體（GPCRs），通過其下游信號(hào)級(jí)聯(lián)發(fā)揮作用，介導(dǎo)較慢的神經(jīng)傳遞，主要起調(diào)節(jié)作用［6］。

代謝型谷氨酸受體1（mGluR1）是腦卒中相關(guān)研究中的另一種谷氨酸受體。由于NMDAR和mGluR1都位于突觸后膜上，因此有可能形成相互作用［6］。研究發(fā)現(xiàn)使用小鼠tMCAO 模型，干擾肽（TATmGluR1 T871-N885 或 TAT-mGluR1P1062-L1085）作用于mGluR1 -NMDAR 蛋白復(fù)合物，可降低梗死程度，具有神經(jīng)保護(hù)作用［6］。其他報(bào)告也表明mGluR1 的拮抗劑可以預(yù)防卒中動(dòng)物模型中的神經(jīng)元損傷［8-9］。

NMDA型谷氨酸受體介導(dǎo)的興奮性毒性一直是腦卒中研究的熱點(diǎn)。許多重要的神經(jīng)功能包括突觸可塑性、記憶形成、情緒控制、大腦發(fā)育和神經(jīng)元存活都需要NMDAR 的生理活性。本文著重介紹了NMDAR 激活在腦卒中的雙重作用、潛在機(jī)制，以及基于NMDAR信號(hào)通路治療腦卒中的最新發(fā)現(xiàn)。

1 NMDA受體在神經(jīng)元存活和死亡中的雙重作用

NMDAR 是四聚體組合體，包括兩個(gè)GluN1 和兩個(gè)GluN2亞基，分別與共晶體甘氨酸和谷氨酸結(jié)合。GluN2 亞型（GluN2A、GluN2B、GluN2C 和GluN2D）及GluN3A 和GluN3B 在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中都具有不同的性質(zhì)和表達(dá)模式［10］。雙重作用可能取決于被激活的受體的亞型。“NMDAR 亞型”假說指出，激活含GluN2A 的NMDARs 導(dǎo)致神經(jīng)元存活和對(duì)缺血損傷的神經(jīng)保護(hù)，而激活含GluN2B的NMDARs可導(dǎo)致興奮性毒性和神經(jīng)元凋亡［11-12］。在成人大腦中含GluN2B 的NMDAR 在突觸外部位富集，而含GluN2A的NMDAR在突觸高度表達(dá)。此外，GluN2C、GluN2D以及GluN3A和GluN3B亞基在介導(dǎo)神經(jīng)元存活和死亡方面發(fā)揮重要作用，如在大腦中動(dòng)脈閉塞（MCAO）卒中動(dòng)物模型中敲除GluN3A 基因小鼠梗死體積明顯大于野生型（WT）小鼠［13］。對(duì)于NMDA 受體亞型的研究為缺血性卒中提供了新的治療方法。NMDAR 在神經(jīng)元存活和死亡中的雙重作用可能取決于被激活的受體的亞型。

2 基于NMDAR受體的干預(yù)措施

2.1 NMDAR 受體拮抗劑與激動(dòng)劑 最新研究發(fā)現(xiàn)，在大腦中動(dòng)脈閉塞（MCAO）模型中，NMDAR 拮抗劑（MK801）僅對(duì)小鼠行為有藥理作用，未能顯示出對(duì)腦梗死的神經(jīng)保護(hù)作用［14］。但并不能克服NMDAR 拮抗劑在許多缺血?jiǎng)游锬Ｐ停ò∕CAO模型）中具有強(qiáng)烈神經(jīng)保護(hù)作用的廣泛證據(jù)［7,15-16］，特別是已開發(fā)出含有GluN2B 的NMDAR 特異性拮抗劑（CP-101,606），研究證明其對(duì)卒中損傷有效［17］。然而，由于治療時(shí)間窗有限、不良反應(yīng)嚴(yán)重或缺乏臨床療效，這些或類似藥物的臨床試驗(yàn)令人失望［18］。近年來，在低pH 下作用的pH 敏感拮抗劑被開發(fā)出來，可以在缺血區(qū)特異性靶向含GluN2B的NMDAR。與傳統(tǒng)NMDAR 抑制劑（如氯胺酮和ro25-6981）相比，該拮抗劑家族的一個(gè)主要候選基因93-31 在tMCAO 小鼠中獲得類似的神經(jīng)保護(hù)效果和較少的不良反應(yīng)［19］。這種新一代含GluN2B 的NMDAR 拮抗劑可能對(duì)卒中患者更具耐受性。然而，這種基于拮抗劑的化合物可能仍然遭受與傳統(tǒng)含GluN2B 的NMDAR 拮抗劑相同的短治療窗口，因此，如果給藥太晚（即在執(zhí)行GluN2B 依賴程序細(xì)胞死亡信號(hào)通路之后），則不能對(duì)抗下游細(xì)胞死亡信號(hào)。

相比之下，增強(qiáng)含GluN2A的NMDA受體可促進(jìn)細(xì)胞存活。最近開發(fā)出GluN2A 特異性正變構(gòu)調(diào)節(jié)劑（PAM）［20］，包括GNE-6901。這些新的GluN2A 特異性PAM 通過激活神經(jīng)元存活信號(hào)保護(hù)神經(jīng)元免受興奮性毒性，比傳統(tǒng)的NMDAR拮抗劑具有更長(zhǎng)的治療時(shí)間和更少的不良反應(yīng)。因此，選擇性增強(qiáng)含GluN2A 的NMDAR，相對(duì)于阻斷NMDAR，是卒中的一種更有前途的治療方法。

2.2 靶向NMDAR 促死亡途徑：NDC（死亡信號(hào)復(fù)合物）中的相關(guān)蛋白

2.2.1 GluN2B-PSD95-nNOS 復(fù) 合 物：GluN2B -PSD95-nNOS 信號(hào)復(fù)合物是神經(jīng)元死亡信號(hào)蛋白與GluN2BRs形成蛋白復(fù)合物，在這個(gè)復(fù)合物中，PSD95作為支架蛋白將nNOS（神經(jīng)元型一氧化氮合酶）與NMDA受體組裝在一起［21］。其中干擾興奮性毒性中NO 生成的一種方法是使用干擾肽（Tat-NR2B9c）結(jié)合PSD95或nNOS，從而干擾NMDAR激活nNOS的能力。這種肽可降低顱內(nèi)動(dòng)脈瘤血管內(nèi)修復(fù)患者的醫(yī)源性缺血性腦梗死發(fā)生率［22］。由于它僅針對(duì)NMDAR-nNOS信號(hào)通路，因此其不良反應(yīng)要比在細(xì)胞表面阻斷NMDAR 的傳統(tǒng)抑制劑小得多。但最新研究表明，Tat-NR2B9c在dMCAO模型中不能預(yù)防腦梗死［14］。相關(guān)報(bào)道顯示［23］，在動(dòng)物模型中小分子化合物（ZL006）可以阻斷nNOS-PSD-95 的結(jié)合，改善大腦中動(dòng)脈閉塞（MCAO）或再灌注引起的局灶性腦缺血損傷。

2.2.2 GluN2B-DAPK1-p53 復(fù)合物：死亡相關(guān)蛋白激酶1（DAPK1）是一種鈣離子/鈣調(diào)素（CaM）依賴的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，其活性與凋亡細(xì)胞死亡相關(guān)［24］。已有報(bào)告稱，DAPK1 基因的缺失或給予藥物（如Tat-NR2BCT）破壞GluN2B-DAPK1 相互作用可以保護(hù)小鼠免受卒中損傷［25］，且使用DAPK1-p53阻斷劑Tat-p53DM對(duì)OGD誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡和壞死具有高度的神經(jīng)保護(hù)作用［26］。

2.2.3 GluN2B NMDAR-PTEN：抑癌基因PTEN（在10 號(hào)染色體上缺失的磷酸酶和張力蛋白同源物）具有脂類和蛋白質(zhì)磷酸酶活性，PTEN的基因敲除在腦缺血中具有神經(jīng)保護(hù)作用［27］。NMDA的興奮毒性可導(dǎo)致神經(jīng)元中PTEN核易位，大鼠局灶性缺血模型證明Tat-K13 不僅可以減少缺血誘導(dǎo)的PTEN核易位，也可以有效地防止缺血性腦損傷［28］，即使在卒中后6 h應(yīng)用也是有效的［28］。

2.2.4 NMDAR-Src-Panx1 complex：體外和體內(nèi)的缺血性卒中模型證明NMDAR 通過一種不需要受體離子通道的機(jī)制導(dǎo)致神經(jīng)元死亡。這種機(jī)制需要配體結(jié)合，但與NMDARs 中的Ca2+內(nèi)流無關(guān)。WEIL?INGER 等［29］報(bào)告了一種由NMDARs、肉瘤（Src）激酶和pannexin-1（Panx1）通道組成的信號(hào)復(fù)合物的存在，這種復(fù)合物與膜泡形成、Ca2+失調(diào)、線粒體功能障礙和細(xì)胞死亡以及卒中后的神經(jīng)功能缺損有關(guān)。使用干擾肽Tat-panx308 阻斷Panx1 C 端的Y308 位點(diǎn)，可以減少M(fèi)CAO 后的梗死面積，具有神經(jīng)保護(hù)作用［29］。

2.2.5 DLK（雙亮氨酸拉鏈激酶）：在成熟的神經(jīng)元中DLK 存在于突觸中，并與多種已知的突觸后密度蛋白（包括支架蛋白PSD-95）相互作用。DLK 基因敲除減弱了JNK/c-Jun應(yīng)激反應(yīng)途徑的活化，降低了紅藻氨酸誘導(dǎo)的神經(jīng)退行性病變的水平［30］。最近人們發(fā)現(xiàn)了一種有效的DLK選擇性抑制劑GNE-3511，其在神經(jīng)退行性病變和神經(jīng)毒性的體內(nèi)模型中具有神經(jīng)保護(hù)作用［31-32］。

3 靶向NDC（死亡信號(hào)復(fù)合物）下游的死亡信號(hào)蛋白

NMDAR 介導(dǎo)的興奮性神經(jīng)元死亡的新靶點(diǎn)不僅局限于NDC，還包括NDC 下游的死亡信號(hào)蛋白。（1）鈣蛋白酶（Calpains）：鈣依賴性半胱氨酸蛋白酶Calpain 參與NMDAR 介導(dǎo)的興奮毒性，激活Calpain可以誘導(dǎo)細(xì)胞死亡，且Calpain 還介導(dǎo)Kidins220/ARMS 下調(diào)［33］、紋狀體富集蛋白酪氨酸磷酸酶（STEP）［34］以及代謝型谷氨酸受體1（mGluR1）［35］的裂解。阻斷這些下游死亡信號(hào)蛋白可提供更寬的治療時(shí)間窗，即使在卒中后6 h 給予治療，Calpain 抑制劑SNJ-1945 在小鼠腦缺血中也顯示出神經(jīng)保護(hù)作用［36］，并且Tat-K（干擾Calpain 介導(dǎo)的Kidins220的裂解［37］）、Tat STEP（干擾calpain 介導(dǎo)STEP［34］的裂解）和TatmGluR1（干擾Calpain 介導(dǎo)的mGluR1 的裂解［35］）也能夠防止體外和體內(nèi)興奮性毒性導(dǎo)致的神經(jīng)元死亡。（2）促分裂原激活蛋白激酶（MAPKs）：MAPKs 蛋白家族中p38 和c-Jun 氨基末端激酶（JNK）在興奮毒性期間被激活［38］，介導(dǎo)神經(jīng)元凋亡。p38 抑制劑（SB-203580 和SB-239063）和JNK抑制劑（TatJBD20）可防止體外和體內(nèi)腦卒中模型中NMDAR 介導(dǎo)的神經(jīng)元死亡［38-40］。即使在卒中發(fā)作后6 h 或12 h 給予藥物治療，也具有神經(jīng)保護(hù)作用［40］。（3）甾醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白（SREBP）：神經(jīng)元中的甾醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白-1（SREBP-1）轉(zhuǎn)錄因子的激活在卒中體外和體內(nèi)模型中NMDAR 介導(dǎo)的興奮性毒性神經(jīng)元死亡中起重要作用，Insig-1 衍生干擾肽（Indip）已被開發(fā)用來阻斷SREBP 的核轉(zhuǎn)位，使用MCAO模型證實(shí)了其對(duì)卒中損傷的治療潛力［41］。（4）α-氨基-3-羥基-5-甲基-4-異惡唑丙酸受體（AMPARs）的內(nèi)吞作用：AMPAR 的內(nèi)吞作用對(duì)N-甲基-D-天冬氨酸誘導(dǎo)的神經(jīng)元凋亡至關(guān)重要，使用干擾肽可以特異性抑制AMPAR 內(nèi)吞作用，具有神經(jīng)保護(hù)作用［42］。

4 總結(jié)與展望

NMDAR在神經(jīng)元存活和死亡中的雙重作用，總結(jié)NMDAR 最新研究進(jìn)展，更好地解釋了NMDAR 拮抗劑應(yīng)用在臨床中失敗的原因，并且對(duì)于開發(fā)基于NMDAR 的更有效的神經(jīng)保護(hù)藥物提供了更好的科學(xué)基礎(chǔ)。此外，作用于NMDAR下游死亡信號(hào)蛋白質(zhì)的干擾肽也被開發(fā)出來，這些干擾肽能夠特異性地抑制下游死亡信號(hào)而不影響受體的其他功能信號(hào)，比傳統(tǒng)NMDAR阻滯劑的不良反應(yīng)小，且具有更寬的治療時(shí)間窗口，為臨床治療腦卒中提供了更有效的新療法。