外泌體在神經退行性疾病中的作用

許鵬飛綜述， 張紅菊，2審校

神經系統退行性疾病發病率逐年上升，仍缺乏修飾性治療策略。外泌體是一種由活體細胞通過胞吞-胞吐方式釋放的小囊泡，具有細胞通訊作用，在神經系統退行性疾病的發生、發展過程中具有重要作用；因此，在疾病的早期診斷和治療上具有重要研究價值。本文針對外泌體與神經系統退行性疾病相互關系的研究綜述如下。

1 外泌體概述

1983年，Pan和Johnstone團隊首次在綿羊網織紅細胞成熟過程中，發現了一種與轉鐵蛋白釋放到細胞外途徑相關的小囊泡，并于1989年定義為外泌體[1]。最初，外泌體被認為是一種清除細胞代謝廢物的運輸工具，越來越多的研究表明，外泌體在細胞通訊過程中起重要作用，能夠反映并影響細胞的生理、病理狀態，其中某些分子成份與疾病的發生、發展、治療有密切聯系[2]。

1.1 外泌體的釋放 細胞外囊泡根據其直徑大小可分為三種，分別為凋亡小體(50～5000 nm)、微泡(100～1000 nm)、外泌體(30～150 nm)。外泌體與細胞凋亡過程中產生的小囊泡不同，外泌體只能由活細胞分泌，且能被體內多種類型細胞分泌，廣泛存在于各種體液中[3]。外泌體通過胞吞-胞吐方式由親本細胞釋放；首先，胞膜內化形成胞內體，胞內體聚集形成多泡體(Multivesicular Bodies，MVBs)，MVBs與親本細胞膜融合，通過胞吐作用將外泌體排出細胞。多種因素通過不同途徑影響外泌體釋放，小GTP酶蛋白的 RAB 家族(RAB27、RAB5A、RAB9A、RAB2B、RAB11、RAB35)通過影響MVBs膜與細胞膜的融合促進外泌體分泌[4]。

1.2 外泌體的通訊作用 外泌體與靶細胞交流通過以下方式：(1)外泌體膜與受體細胞膜相互融合，釋放所攜帶物質進入受體細胞。(2)通過配體受體之間相互作用激活信號通路。(3)細胞通過胞吞作用將整個外泌體內化后，與溶酶體融合，將所攜帶物質釋放入受體細胞。此外，內化后的外泌體還可以與MVBs融合，再次被分泌出細胞外[5]。

1.3 外泌體的組成 外泌體由構成性分子和運載分子共同組成，構成性分子取決于釋放外泌體的親本細胞種類，其外側雙層膜結構主要成分為脂質和蛋白質。外泌體的構成及運載分子包括RNA、脂質及蛋白質，其中蛋白質包括四次跨膜蛋白(CD9、CD63、CD81、CD82)、Flotillin、Alix、TSG101、和熱休克蛋白 (Hsc70、Hsp90) 等[6]，四次跨膜蛋白常被作為外泌體鑒定標志物。Flotillin主要用于膜蛋白之間的相互交流與信號轉導，研究表明Flotillin可作為阿爾茲海默病(Alzheimer disease，AD)診斷的新型標志物[7]。外泌體還攜帶有mRNA、miRNA、lncRNA、circRNA，并轉移至其它細胞中發揮生物學調控作用，成熟miRNA的一條單鏈可與某些蛋白質相互作用，形成RNA誘導沉默復合物(RISC)[8]調節蛋白質表達。不同外泌體的運載分子不盡相同，這與外泌體親本細胞和外泌體形成過程中各種生理和病理條件有關。

2 外泌體與神經系統退行性疾病

2.1 外泌體與α-突觸核蛋白病 α-突觸核蛋白(α-synuclein，α-syn)是大腦中大量存在的一種可溶性蛋白質，尚不明確其健康狀態下的功能，但錯誤折疊和纖維狀聚集的α-syn沉積在中樞及周圍神經系統中將導致一系列α-突觸核蛋白病發生，如帕金森病(Parkinson’s disease，PD)、路易體癡呆(Dementia with Lewy bodies，DLB)等。PD是僅次于AD的第二大類神經系統退行性疾病，65歲以上人群發病率為2%[9]。其病理特征是α-syn構成的路易小體(Lewy Body，LB)在神經元胞體和軸突內沉積[10]。目前認為神經元功能受損甚至死亡是由α-syn寡聚體引起的。α-syn可被分裝入外泌體釋放到細胞外環境，導致類似于朊病毒樣的病理傳播。實驗發現，PD患者血清外泌體中α-syn含量多于正常對照組[11]，且α-syn以寡聚體形式存在于血清外泌體中；但PD患者腦脊液總α-syn含量低于正常對照組，可能是中樞神經系統由于某種保護機制向血液系統中轉運α-syn增加，其具體機制需進一步研究。將PD患者血清外泌體接種細胞，可致其表達α-syn單體及寡聚體增加；且用PD患者腦脊液外泌體接種健康小鼠，會使小鼠腦脊液中α-syn的表達水平呈劑量依賴型增加[12，13]，故PD患者血清和腦脊液外泌體可以促進靶細胞中α-syn形成。依賴于完整的外泌體傳播途徑，與游離α-syn相比，外泌體中α-syn更容易被受體細胞內化，在神經系統傳播中，毒性更大。

外泌體形成和分泌過程受自噬-溶酶體途徑(ALP)調節。ALP異常時，蛋白質清除能力下降，并影響PD及DLB的發生發展；ALP受損將導致細胞內α-syn寡聚體的清除效率降低，引起α-syn寡聚體向細胞外釋放增加，導致外泌體中α-syn寡聚體在細胞間傳播，加速疾病進展[14]。

小膠質細胞被認為是傳播α-syn寡聚體導致PD進展的潛在載體。用α-syn處理BV-2小鼠小膠質細胞，發現α-syn可以誘導小膠質細胞分泌外泌體增加，將此外泌體與神經元細胞共培養可致神經元細胞凋亡增多，說明外泌體在小膠質細胞介導PD的進展過程中扮演重要角色[15]。將DLB患者腦組織的外泌體接種細胞，可觀察到α-syn在細胞中聚集[16]，接種至健康小鼠大腦中，會導致α-syn在神經元細胞中聚集[17]，說明DLB患者腦組織源性外泌體可使DLB病理播散，加重病情。研究發現，處于進展期的DLB患者腦脊液外泌體α-syn水平較高，且α-syn含量與MMSE得分呈負相關[13]，這表示DLB患者腦脊液外泌體α-syn含量可能與疾病活動有關，且影響患者的認知水平。雖然PD患者腦脊液外泌體接種小鼠會導致小鼠腦脊液中α-syn含量增加，但尚未觀察到PD患者腦脊液外泌體α-syn含量與UPDRS分期的相關性。

2.2 外泌體與AD AD的病理特征為β-淀粉樣蛋白(Amyloid β-protein，Aβ)沉積形成神經炎性斑，及過度磷酸化Tau蛋白在神經元內形成神經原纖維纏結。AD患者的病理斑塊中有大量的Aβ及外泌體特定標志蛋白Alix存在，Rajendran等發現Aβ可通過外泌體分泌至細胞外，并證實了外泌體具有在細胞間傳播毒性Aβ和高磷酸化Tau蛋白的能力，當外泌體途徑被阻斷可減弱Aβ聚集和傳播[18，19]。有研究報告：小膠質細胞減少可以抑制Tau蛋白增殖，小膠質細胞外泌體合成受到抑制，可降低Tau蛋白的繁殖與傳播[20]，這說明小膠質細胞外泌體在AD的發生發展中同樣具有重要研究價值。另有研究發現：輕度至重度(Braak 3-6期)的AD患者，腦脊液外泌體中磷酸化Tau蛋白濃度顯著高于早期階段(Braak0-2期)[21]，這表明外泌體相關的磷酸化Tau蛋白與疾病的進展有關。

3 外泌體在神經系統退行性疾病中的應用價值

外泌體存在于各種體液中，便于獲得，其成分特異，所攜帶物質不僅能反映親本細胞的生理和病理狀態，并且外泌體可保護其攜帶的miRNA、蛋白質等穩定存在，不被核酸酶和蛋白酶降解，因此，可成為神經系統退行性疾病的診斷重要標志物；因其具有穿過血腦屏障的功能，對其進行修飾、裝載，將成為藥物治療的載體，可在神經系統退行性疾病的治療中發揮重要的作用。

3.1 外泌體與神經系統退行性疾病的診斷 神經系統退行性疾病起病隱匿，早期無明顯臨床癥狀，但生物特性的變化已經在外泌體中體現，因此，外泌體的改變可為疾病早期診斷提供依據。目前PD的診斷多依賴于臨床癥狀，但當紋狀體中70%至80%和黑質中50%的多巴胺能神經元丟失時[22]，才出現運動癥狀，因此，PD早期診斷的生物學標志物有待進一步明確，人們正在嘗試從腦脊液、血液、尿液中提取外泌體及外泌體攜帶物質進行PD早期診斷的探索。

與腦脊液相比，血液和尿液樣本更易獲得，但外周血中血小板和紅細胞會產生大量的α-syn，若制備樣本時發生溶血則影響血漿外泌體中α-syn檢測結果。在PD患者尿液外泌體中可檢測到與PD相關的LRRK2蛋白[23]，但由于LRRK2在人體內表達多變，不能得到穩定的檢測結果，因此不能用于PD的早期診斷。DJ-1是一種由189個氨基酸構成的蛋白質，具有抑制α-syn聚集的作用，有研究發現男性PD患者尿液外泌體中DJ-1與正常人存在明顯差異[24]，但研究樣本量較小，能否成為未來診斷標志物仍需進一步驗證。

腦脊液可直接反映腦內病理變化，故使用腦脊液外泌體樣本對疾病診斷更精確，但不易獲得。對腦脊液外泌體miRNA分析發現PD患者腦脊液外泌體較正常對照組有16個miRNA表達上調，11個miRNA表達顯著下調，而miR-153、miR-409-3p、miR-10a-5p顯著過度表達[25]，這些差異有望成為PD早期診斷標志物。

Aβ在腦內沉積是一個長期緩慢過程[26]，對AD臨床前期診斷有助于早期干預疾病發生發展。研究表明AD患者血漿腦源性外泌體中總Tau蛋白、P-T181-tau、P-S396-tau和Aβ1-42水平均顯著高于正常對照組，在認知正常的高危患者中可檢測到磷酸化Tau蛋白、P-S396-tau和P-T181-tau，這些改變可追溯到AD診斷的10 y前。動態檢測發現，從臨床前的高危人群到AD確診，患者血漿外泌體Aβ1-42水平由逐漸升高到顯著增高[27]，因此，血漿外泌體Aβ1-42具有刻畫AD進展的價值。

外泌體的標志蛋白Flotillin是位于外泌體脂筏上的疏水性蛋白，可通過影響Ca2+穩態、線粒體功能參與AD的發病。一項臨床研究發現：與非AD人群相比，AD患者腦脊液和血清中Flotillin水平顯著下降，用11C-匹茲堡化合物B (11C-PiB)正電子發射斷層攝影(PET)成像技術分析Aβ沉積，發現血清Flotillin水平與Aβ沉積負相關[28]，這表明血清Flotillin水平可用來評估Aβ沉積，可用于早期診斷。

3.2 外泌體與神經系統退行性疾病的治療 外泌體經改造后可回輸至自體，減少因藥物載體帶來的免疫反應，提高治療的安全性，且由于其能夠通過血腦屏障，故可用外泌體作為藥物載體對神經系統退行性疾病進行靶向治療。中國研究團隊通過飽和溶液孵育法，成功有效的將多巴胺裝載入血漿外泌體中，通過動物實驗證實，裝載入血漿外泌體的多巴胺透過血腦屏障，被成功傳送至大腦的黑質和紋狀體，且多巴胺在腦內分布增加了15倍以上[29]。有研究團隊將過氧化氫酶(強效抗氧化劑)在不改變外泌體結構的情況下裝載入外泌體，攜帶過氧化氫酶的外泌體透過血腦屏障，富集在神經元細胞和小膠質細胞[30]，發揮強大的保護作用。此外，有研究將抗α-syn的shRNA微環(shRNA-MCs)裝載入被狂犬病毒糖蛋白肽修飾過的外泌體(RVG-exosome)，并通過尾靜脈接種PD小鼠，發現PD小鼠腦中α-syn表達減少、聚集水平降低，且黑質致密部多巴胺能神經元丟失減少，臨床癥狀改善[31]。最近有研究將含有中性內肽酶(NEP)和胰島素降解酶(IDE)活性的間充質干細胞外泌體注射AD模型小鼠，發現小鼠的Aβ斑塊沉積減少[32]。Wang H等將姜黃素(curcumin，cur)誘導的外泌體(exosome-cur)注射入岡田酸(Okadaic Acid，OA)誘導Tau過度磷酸化的AD小鼠，觀察到exosome-cur可以通過AKT/GSK-3β通路抑制Tau蛋白的磷酸化[33]，且小鼠的認知功能得到改善。上述的研究結果將為PD、AD及其他神經系統退行性疾病的治療提供新的方法。

4 小 結

隨著人口老齡化加劇，神經系統退行性疾病發病率越來越高，給患者、家庭及社會帶來巨大影響，探究其病理，對其進行早期診斷、早期干預成為當下解決問題的重點。對外泌體進行探索發現其與神經系統退行性疾病有巨大聯系，雖然目前僅在研究階段，實際應用還面臨諸多困難，但其仍不失為一種有前途的方法。