細菌性肝膿腫的實驗室檢查及病原體檢測研究進展

張 威，陳國林

(哈爾濱醫科大學附屬第一醫院 感染科，黑龍江 哈爾濱150001)

細菌性肝膿腫(Pyogenic liver abscess,PLA)在東亞地區是一種較常見的肝臟感染性疾病，死亡率達2-12%[1]。研究發現PLA在糖尿病、營養不良和免疫抑制等患者中發病率增加[2]。最近一項基于美國人口的研究顯示[3]，在過去的35年中，PLA的發病率增加了2倍多，報道稱發病率的增加歸因于肝膽介入治療頻率增加和生物多藥耐藥性。雖然隨著引流技術的發展和抗生素的廣泛應用，PLA有了更好的預后，但如不及時診斷并給予合適的治療，仍可發展為致命的結局，且該病并發癥復雜，如并發內源性眼內炎雖經積極治療仍不能獲得滿意效果。

由于大部分PLA的癥狀是感染引起的，是非特異性的，因此很難及時診斷，研究發現[4]，PLA患者主訴癥狀持續時間中位數為1周，另外1/4的患者在前1-2周就已經出現癥狀，還有一部分患者為體檢發現。PLA的實驗室檢查結果也相對缺乏特異性[5]，但具有預測和提示意義。雖然實驗室檢查本身并不能診斷PLA，但實驗室異常通常會促使進一步結合影像學等做出診斷。

PLA可根據致病菌分類,確定病原體可以一定程度上預測潛在的并發癥，幫助早期識別并制定治療方案[2]。不僅如此，針對病原體的治療可避免不規范應用抗生素的情況，從而減緩耐藥問題。研究發現[3]在過去的20年中，由多藥耐藥微生物引起的感染顯著增加，比例從14%上升至51%。但由于PLA患者多數存在發熱的癥狀，相當一部分在院外已經應用抗生素，這導致傳統培養方法的陽性率減低，給病原體鑒定造成干擾，因此開展新技術鑒定PLA病原體是日后發展的趨勢。伴隨病原體的變遷及糖尿病和惡性腫瘤等免疫障礙患者的數量增加，PLA的病因、診斷和治療發生了很大的變化。因此，PLA的臨床診療面臨著新的挑戰。本文針對PLA的實驗室檢查及病原體檢測的研究現狀及進展展開綜述。

1 實驗室檢查

PLA患者實驗室檢查較常見的異常是白細胞計數升高和感染誘發的血小板減少。肝功能異常常見低白蛋白血癥、膽紅素升高、轉氨酶、堿性磷酸酶升高和γ谷氨酰轉肽升高，炎癥指標C反應蛋白(C-Reactive Protein,CRP)升高等等[4-7]。一項研究指出[7]最常見的實驗室異常分別是98%和93.9%的病例中CRP和纖維蛋白原水平升高，其次是77%的患者白細胞結果異常，67%的患者堿性磷酸酶升高。并對他們之中34名患者給予降鈣素原(PCT)檢查，回報被檢測患者的PCT水平均升高。白細胞計數的增加通常與PLA感染有關，但可能受到幾種共存的非感染因素的影響，因此白細胞診斷能力較低。但研究表明[8]白細胞增加、血漿白蛋白減少與PLA膿腫的大小相關。研究指出[9]合并膽道疾病的PLA組的谷丙轉氨酶、堿性磷酸酶和總膽紅素水平高于無膽道疾病的PLA組，實驗室檢查也能輔助判斷PLA的病因。

1.1 C反應蛋白

PLA患者的CRP幾乎都存在不同程度的升高，研究認為[9]CRP在 PLA 中是反應炎癥程度和評估抗感染治療效果的一項簡單有效和敏感的指標。研究顯示[10]CRP正常后停用抗生素組和體溫正常至少2周停用抗生素組經皮穿刺引流后抗生素治療時間分別為15.83±6.45天和24.25±8.18天，CRP指導停藥組用藥天數明顯少于體溫指導停藥組(P=0.001)。兩組復發率均為0%，因此CRP值可作為決定經皮引流后的PLA抗生素治療持續時間的獨立因素。Law等研究表明[11]每周檢測CRP有助于識別哪些PLA患者具有良好預后，并且能識別抗生素充分治療療程為5周或更短時間的患者。一項薈萃分析指出[12]，使用CRP指導的抗生素治療與新生兒抗生素使用時長縮短相關。同樣，基于CRP的算法也減少了成人門診患者的抗生素使用。另外，研究認為血清CRP可能是鑒別腫塊型肝內膽管細胞癌(IMCC)和PLA的潛在標志物。其他炎癥指標包括白細胞總數、中性粒細胞絕對值/淋巴細胞絕對值(NLR)、Delta中性粒細胞指數(DNI)、血小板減少率和CRP在PLA組明顯高于IMCC組。對兩組而言，初始CRP值的曲線下面積顯著高于初始血清白細胞計數、血小板減少率和DNI水平的曲線下面積(曲線下面積:0.909)。血清CRP(OR 1.290，95%CI 1.148-1.449，P<0.001)是區分PLA組和IMCC組的唯一顯著預測因子[13]。不僅如此，基于人群的研究中發現PLA的幾個不良預后因素，如年齡、惡性腫瘤、腎功能損害和敗血癥，與CRP水平較高相關[14-15]。

1.2 降鈣素原

血清PCT是臨床工作中細菌感染常見的生物標志物，對抗感染治療也具有指導意義。研究中[9]，155名PLA患者中位PCT水平為3.14 ng/mL，95.5%(148/155)的PLA患者的PCT大于0.05 ng/mL。此外，4.5%(7/155)的患者的PCT檢測結果正常。這是因為PCT的半衰期不長(20至24 h)，在局部細菌感染中通常是正常的或略有增加。此外研究還表明[16]，PLA并發膿毒血癥組的平均PCT水平高于PLA不合并膿毒血癥的亞組(P<0.001)；其他數據包括中性粒細胞計數和百分比顯示兩組間沒有顯著差異。血清PCT水平是原發性肝癌患者經肝動脈化療栓塞治療后診斷PLA合并膿毒癥的指標，PCT的臨界值為5.1 ng/mL，在預測PLA合并膿毒癥中具有較高的特異性和敏感性。

1.3 Delta中性粒細胞指數

急診入院時的高DNI指數水平是初始血流動力學穩定的PLA患者發生院內低血壓的獨立預測因子(OR:1.44，95%CI:1.06-1.95，P=0.02)。DNI大于3.3%與急診入院發生院內低血壓有關(OR:5.37，95%CI:2.91-9.92，P<0.001)[17]。最近的一項研究顯示[18]，NLR與PLA患者的預后明顯較差有關。但在預測住院低血壓方面，急診入院時的DNI的效能優于白細胞、中性粒細胞、CRP水平和NLR,DNI具有類似快速序貫器官功能衰竭評分(qSOFA評分)的作用[17]。未來需要對更多患者進行前瞻性多中心研究，以驗證DNI在確定治療充分性方面的有效性，及是否可作為對初始穩定的PLA患者進行緊急干預的時間點的標志。

2 病原體的變遷與檢測

2.1 病原體的變遷

PLA在全球均有分布，各地的致病微生物譜各不相同。在西方一些國家，鏈球菌和大腸桿菌占主導位置。中國1項Meta分析顯示[19]，在PLA中最常檢出菌為大腸桿菌和肺炎克雷伯菌，二者共計(83%)。大腸桿菌導致的PLA多為膽道源性且更易發生黃疸和膿毒癥休克，多變量分析顯示，大腸桿菌是一個獨立死亡因素[20]。

近些年肺炎克雷伯菌肝膿腫(KPLA)的病例報告出現頻次顯著增加，現超越大腸桿菌，不僅僅是亞洲地區最主要的病原體，在歐洲發病率也有升高趨勢。肺炎克雷伯氏菌有特定的毒力因子，因此被稱為傳播全球的高毒性菌株[1]。KPLA在糖尿病的患者中常出現，在一項亞洲研究中，KPLA的糖尿病患病率為61%，而除此之外其他PLA的糖尿病患病率為51.4%。可能因為血糖控制欠佳會影響嗜中性粒細胞對克雷伯氏菌K1/K2莢膜的吞噬作用，從而阻止對細菌的免疫反應[21]。最近美國安全網醫院研究也表明[22]，最常見的PLA危險因素是糖尿病、既往肝臟手術和肝臟惡性腫瘤。其中有6名患者，糖尿病是他們唯一的危險因素。研究還發現產氣性膿腫也和肺炎克雷伯菌感染相關，且死亡率高[23]。同時KPLA患者需要密切關注肝臟以外的侵入性表現，稱為侵襲綜合征，通常由高毒力肺炎克雷伯菌引起。最新研究發現[24]，毒力基因iutA在高毒力和普通肺炎克雷伯菌兩組之間有顯著差異(P=0.002),可以作為高毒力肺炎克雷伯菌的一個分子標志物。內源性眼內炎是KPLA侵襲綜合征中一種毀滅性的并發癥，部分患者經過外科及抗感染治療仍不能恢復[25]。另外，在回顧性研究中發現大多數PLA的病例均是隱源性的[9，26]，這可能與肺炎克雷伯桿菌的流行相關。有人認為隱源性肝膿腫是隱匿性胃腸道惡性腫瘤的標志，1項薈萃分析給出的結論是隱源性PLA人群可考慮進行結腸鏡篩查，尤其是KPLA的人群[27]。

還有一些特殊細菌可導致PLA，例如極少的布魯菌氏病也可并發PLA，它與外科急腹癥臨床癥狀類似[28]。梭桿菌引起的PLA通常只發生在最近患有牙周病或咽炎的免疫活性宿主中[29]。PLA的病原體在地理上是多樣的，不同國家之間存在差異，但由于全球人口的流動增加，病原體也隨之變化。因此在鑒別診斷中，結合當地流行情況的同時，也必須越來越多地考慮以前不太頻繁的病原體。

2.2 病原體的檢測

病原體的及時檢測不僅對明確的診斷治療至關重要，而且對監測病情和感染控制也至關重要。在嚴重感染的患者中，病原體識別的延遲導致不及時和不適當的抗菌治療，并最終導致更高的死亡率[30]。大約一半的肺炎克雷伯菌血癥相關死亡發生在入院后的前72 h內[30]。然而，常規方法通常需要3-5天才能達到最終微生物學診斷[31]。雖然越來越多的病原體被報道出來，其中包括罕見的病原體，但對臨床醫生來說界定微生物病原體仍存在困難，實際工作中，許多患者在采集血或穿刺液標本前已經接受抗生素治療，這種情況會導致病原檢出率降低，陽性培養結果可能具有更高的耐藥性，也可能低估了原有病原體的數量。但多數醫院現仍以傳統培養為主要手段，周期長且存在結果偏倚。目前二代測序(next-generation sequencing，NGS)等技術用于PLA的病原體的鑒定,有一定的臨床價值，且具有精準、快速、廣泛適用性、靈敏度高、可定量分析的優勢[32-33]。

2.2.1血培養和濃汁培養 引起PLA的病原體種類繁多，目前的診斷主要依賴于病原體培養，但耗時、繁瑣且容易出錯。此外，常規培養方法的最大局限性之一是并非所有的病原體都適合培養，這可能是導致較低檢出率的原因[32]。血液培養是診斷PLA的重要輔助手段，建議對任何疑似PLA的患者進行血液培養,即使獲得陽性率更高的穿刺液標本，也不能忽略血培養的作用。膿汁和血液標本培養陽性率分別為81.3%(208/256)和25.2%(30/119)，導致這種結果的原因可能是多數感染局限在肝臟。值得注意的是，膿腫引流在最初放置導管時就應送檢，隨后可能被皮膚菌群感染，必要時血培養和濃汁培養均可重復，確保始終有針對的治療[8]。

2.2.2二代測序技術 研究顯示[32]NGS方法對細菌或真菌的檢出率為95.0%(19/20)，按培養方法檢測為60.0%(12/20)，相對于傳統的培養，NGS具有明顯優勢(P=0.008)，尤其是在那些使用過抗生素的樣本中更為明顯。最近的1例病例報告[33]顯示了NGS在PLA患者中的應用，NGS鑒定病原體為肺炎克雷伯菌以及變棲克雷伯菌，過程中臨床醫生有效利用NGS可定量分析的特點，動態定量監測血流中病原體負荷，根據NGS報告結果制定下一步增減抗生素的治療方案，最終患者NGS僅能檢測到少量的肺炎克雷伯菌，血培養回報陰性，好轉出院。另一項研究表明[34]，16S核糖體RNA分析用于PLA培養陰性病例的子集，可將診斷率提高了13%，只有3/17(17.6%)樣本呈陰性。現階段，通過高通量測序可以靶向檢測耐藥基因的突變，對臨床用藥提供及時的指導意見，也對患者的預后情況提供了預估標準[35]。NGS不依賴病原體的分離培養，即便是微量病原體，傳統培養回報陰性的情況下，運用NGS方法也可獲得其基因信息，原理是檢測過程中直接提取標本中全部核酸片段，獲得數據包括病原體序列數、覆蓋度等[32-33]。當然，該技術也存在弊端，未能區分活的或死的病原體是NGS技術的巨大局限性，需要加以考慮并迫切解決。由于這個原因，NGS作為一種半定量技術，某些情況下無法清楚地證明病原體與疾病進展之間的關系，從而影響臨床治療效果的判斷[32]。

2.2.3納米孔測序技術 Gong 等[36]使用納米孔測序對PLA中的肺炎克雷伯菌菌株進行非培養依賴性分析。應用納米孔測序技術鑒定引起PLA的病原體，由于細胞群受到高度污染，通過使用脫氧核糖核酸酶差速離心成功降低了人類脫氧核糖核酸的混雜效應。借助DNA 酶消化去除人源線性DNA，對處理后的樣本進行 MinION 測序，生物信息分析，進行實時病原體鑒定，4 h內便識別出肺炎克雷伯菌2種亞型，并同時找出了emrB等多個耐藥基因，極大地縮短了病原體鑒定的時間，為臨床感染實時診斷與抗生素用藥提供了重要參考。通過整合實時納米孔測序和生物信息學軟件，可以實現PLA病原體的快速檢測，MinION單分子納米孔測序儀將有望成為臨床微生物診斷中一個頗有價值的補充工具。這項技術在超長讀長、實時測序和便攜性等方面的優勢，使其在病原體檢測方面的應用越來越廣泛[37]。

盡管傳統的血培養和濃汁培養靈敏度和可獲得性有所限制，但仍應收集所有PLA患者的血培養，新的技術和方法作為傳統方法的補充而非替代。由于耐多藥微生物的不斷出現和對抗它們的新藥物的有限開發，已引起一場迫在眉睫的危機，尤其是對于革蘭氏陰性菌。控制感染是我們目前的主要防御措施，未來應普及新技術的應用，提高病原體的檢出率，如NGS等技術能夠準確、快速地篩選出與病原體及其耐藥性發展密切相關的多種基因靶點[32]，減少抗生素濫用及過度治療，從而幫助減緩耐藥引發的危機。

3 小結

PLA由于其全球各地病原學不同，疾病特點各異，給及時診斷帶來挑戰。實驗室檢查雖相對缺乏特異性，但有提示和預測意義，且貫穿診療始終，應加強重視。受抗生素使用不規范以及介入治療頻率的增加等因素影響，多藥耐藥微生物不斷出現，造成一部分患者無藥可治的局面。而且目前多數PLA患者仍僅應用傳統培養方法進行病原體的鑒定，陽性率低且耗時較長，日后應著力于病原檢測新技術的應用以及新藥研發。目前PLA的研究中使用的抗生素種類繁多，為了消除這一混雜變量，需要更多來自控制抗生素使用的隨機對照試驗的數據。且許多數據來自單中心，這些規律是否能推廣到其他地區和人種，相關問題值得深入探索。