紡錘體檢驗點蛋白在卵母細胞減數分裂過程中的研究進展

張 越 孫洪亮 王成祥 種海玲 李清春

濱州醫學院附屬醫院生殖醫學科，山東濱州 256600

隨著卵泡生長，雌性哺乳動物生殖細胞首先發育為初級卵母細胞，進入生發泡期（germinal vesicle，GV），并暫時停留在GV 期；減數分裂恢復的標志是生發泡破裂（germinal vesicle breakdown，GVBD），隨后微管蛋白開始組裝成微管，染色體開始形成，進入第一次減數分裂前期，此時同源染色體聯會，四分體形成；當所有四分體排列在赤道板上時，即到達第一次減數分裂中期（MⅠ期），隨后進入第一次減數分裂后期（AⅠ期），同源染色體分離，此時稱為第一次減數分裂末期（TⅠ期），同時排出第一極體；隨后卵母細胞第二次減數分裂的紡錘體迅速形成，卵細胞停留在第二次減數分裂中期（MⅡ期）等待受精完成[1-2]。在卵母細胞減數分裂整個過程中，紡錘體檢驗點（spindle assembly checkpoint，SAC）在分裂中后期發揮著重要作用，保證雙極紡錘體形成、完成染色體與微管的連接以及在進入后期之前完成染色體在赤道板上的排列[3]。卵母細胞減數分裂是一個復雜的生物過程，最終準確完成二倍體的親代細胞產生單倍體的配子。

然而，SAC 在卵母細胞減數分裂過程中的功能研究仍存在很大的爭議。酵母和蒼蠅在沒有功能性SAC的情況下仍可以有效地完成染色體排列[4]。而SAC 對高等生物的生存繁育至關重要[5]。研究證明[3]，SAC 系統參與雌性哺乳動物卵母細胞減數分裂的調控，防止胚胎非整倍體的發生。本文為了更好地認識SAC 蛋白在卵母細胞減數分裂過程中的調控機制，分別探討了四種SAC 蛋白在卵母細胞減數分裂過程中的定位及對非整倍體發生的作用機制。

1 激酶B

激酶（Aurora）為絲氨酸/蘇氨酸激酶蛋白家族亞類，包括Aurora A、Aurora B、Aurora C；Aurora B 是染色體乘客復合體（chromosomal passenger complex，CPC）的一員，是對正確調節染色體排列、胞質分裂和動粒-微管相互作用所必需的，被認為參與了SAC 信號的維持[6-7]。Aurora B 在細胞周期中是動態定位的，有絲分裂中期集中在內部著絲粒染色質，后期定位于紡錘體中間帶[8]。在哺乳動物細胞中，Aurora B 功能喪失會影響TERF1/TRF1（端粒保護蛋白復合物的一個組成部分），進而導致端粒結構異常[9]。而Aurora B 的擴增或表達增加已被證明與各種人類惡性腫瘤的不良預后有關[10]。

Aurora B 控制動粒-微管的附著，調節有絲分裂和減數分裂中的關鍵事件，如凝聚蛋白結合和染色體凝聚、染色體定向、中央紡錘體的形成、染色體臂及端粒的分離等[11]，是影響染色體分離和動粒微管結合的關鍵因子。Aurora B 在染色體正確分離和維持基因組的完整性中起著十分重要的作用，在動粒正確地附著在微管之前，始終保持其活性[12]。Aurora B 主要是通過磷酸化修飾激活底物發揮生物學功能，它負責細胞有絲分裂過程中組蛋白H3 絲氨酸Ser10 的磷酸化（H3S10P），H3S10P 已被證明是Aurora B 活性激活的標志[13]。實驗證實，H3S10P 參與豬卵母細胞減數分裂過程，并影響豬胚胎有絲分裂的細胞周期進程[14]。Chen 等[15]研究顯示，小鼠胚胎的第一次分裂過程中，抑制Aurora B 影響了早期胚胎的發育，表明Aurora B是SAC 成分[如有絲分裂阻滯缺陷蛋白2（mitotic arrest deficiency 2，Mad2）]定位到動粒所必需的，可能通過參與SAC 來調節染色體分離及防止第一次卵裂相關的非整倍性事件的發生。Aurora B 通過破壞不正確的動粒-微管連接影響有絲分裂檢查點功能，是胚胎發育過程中調節染色體異常關鍵的有絲分裂調節因子，它在防止體外受精胚胎染色體非整倍性的發生和降低植入前失敗率方面起著重要作用[6]。

2 紡錘體檢驗點蛋白E

紡錘體檢驗點蛋白E（centromere-associated protein E，CENP-E）是有絲分裂動粒纖維層的組成部分，它包含一個ATP 水解運動域，促進微管末端定向運動[16]。人類CENP-E 由2701 個殘基組成，CENP-E 的動粒靶向結構域包含殘基2126-2476，其后是微管結合區；人類CENP-E 結構域包含四個半胱氨酸殘基，每個半胱氨酸殘基都是其馬達結構域運動所必需的[17]。分子動力學模擬顯示，人類CENP-E 的Y63H突變體降低了其ATP 結合親和力，破壞了CENP-E 馬達結構域的ATP 結合區的構象，并與癌癥進展相關[18]。CENP-E是一種紡錘體檢驗點蛋白，參與其他檢驗點蛋白與動粒結合，如有絲分裂檢驗點蛋白BubR1 抗體（mitotic test point protein BubR1 antibody，BubR1）、 絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶1 （budding uninhibited by benzimidazole 1，Bub1）、絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶3（budding uninhi bited by benzimidazole 3，Bub3）、有絲分裂阻滯缺陷蛋白1（mitotic arrest deficiency 1，Mad1）和Mad2。CENP-E 在核膜破裂后不久就與動粒結合，在中期到后期轉換過程中，CENP-E 表現出從動粒到中央紡錘體中部的動態分布，在分裂的后期或末期，它被重新定位到紡錘體微管[19-20]。研究表明[21]，小鼠卵母細胞中注射抗CENP-E 抗體后完全阻止了卵母細胞進入AⅠ期，所有卵母細胞在MⅠ期被阻斷，這表明CENPE 參與減數分裂過程的染色體運動。CENP-E 的抑制或耗竭導致嚴重和持久的染色體排列缺陷，許多染色體無法向紡錘體赤道板方向排列，并停留在紡錘體極點附近，導致SAC 逐漸地激活[16，22]。Tovini 等[23]采用CENP-E 抑制劑抑制體細胞后，導致染色體排列錯亂。

CENP-E 是一種末端定向的驅動馬達蛋白，是中期染色體組裝所必需的，它在動粒外層累積，并介導動粒-微管的捕獲，沿著紡錘體微管向赤道板運輸染色體；CENP-E 在動粒-微管連接過程中與BubR1、Aurora B 和核心動粒成分相互作用，它參與有絲分裂和減數分裂過程中的動粒-微管捕獲、 中期染色體組裝和排列、紡錘體組裝檢查點的調節[24]。染色體排列過程中微管捕獲和結構維持需要CENPs[25]。此外，CENP-E 通過姐妹染色單體的橫向滑動介導染色體分離，在缺乏CENP-E 的情況下，Aurora B 保留在著絲粒處，并表現出高度Aurora B 激酶活性，這導致紡錘體組裝檢查點的激活；Aurora B 與CENP-E 相互作用，通過減少近極端動粒-微管的穩定附著來調節單向極性染色體組裝[26]。

3 Mad1

Mad1 是有絲分裂檢查點蛋白中進化上較保守的核心蛋白之一，人Mad1 是一種由718 個氨基酸組成的蛋白質，Mad1 的全長結構尚未破解，主要是由于重組Mad1 的溶解度低[27]。Mad1 的N 端結構域（1～485 個殘基，Mad1NTD）被認為是將蛋白質靶向結合到核膜或動粒所必需的，并與許多其他蛋白質相互作用[28]。Mad1 通過其中間區域的Mad2 相互作用基序（Mad2-interacting motif，MIM）與Mad2 形成獨立的細胞周期復合物，這種復合物富含未附著的動粒，構成有絲分裂檢查點的信號放大機制；Mad1 作為最重要的檢查點蛋白之一，還可以形成一個細胞周期獨立的Mad1:CMad2 復合物，以催化Mad2 O-C（open-closed）在未附著動粒上的轉化，從而放大有絲分裂檢查點的信號[27]。

近年來，國內外文獻對Mad1 與Mad2 比率（Mad1∶Mad2）在減數分裂紡錘體檢查點中的作用進行了研究報道。不論Mad1 和Mad2 蛋白的總量是否只有正常水平的一半，染色體丟失方面的缺陷可以通過恢復Mad1∶Mad2 的補償性變化來逆轉[29]。由此得出，在檢查點功能的某些方面，Mad1∶Mad2 比Mad 蛋白質總量更具有代表意義。

4 Bub1

Bub1 為Bub 家族成員之一，在減數分裂紡錘體檢查點功能中起著重要的作用，在小鼠卵母細胞GVBD 期到AⅠ早期Bub1 定位于動粒上，并于AⅠ晚期在動粒上消失，而在MⅡ期重新定位于動粒上[30]。Bub1 決定許多靶標的動粒募集，包括CENP-E、CENP-F、Bub3、Mad3/BubR1、有絲分裂著絲粒相關驅動蛋白、Mad1 和Mad2[31]。

敲除細胞Bub1 基因顯示染色體組裝缺陷，導致染色體分離錯誤[4]。Bub1 保守的C-末端尾部在調節染色體組裝中起作用，且負責CENP-F 的募集，獨立于激酶活性。根據最近在HeLa 細胞中的另一項研究[32]，Bub1 的C 末端可能會招募更多的下游靶點，因為Bub1 與許多動粒蛋白的招募有關。在人類細胞中，通過RNA 干擾（RNA interference，RNAi）敲除Bub1 也會導致染色體排列錯誤及導致明顯的SAC 缺陷[33]。

5 小結

細胞分裂是一種由多種蛋白質調控通路參與的復雜的生命活動，各種蛋白的功能、作用途徑、調控方式相互作用，確保細胞分裂正確進行。紡錘體檢查點通過暫時停止染色體分離和隨后的細胞分裂來確保基因組的保真度，直到所有動粒有效地附著到紡錘體上；SAC 對動粒-微管連接狀態的反應被精細調節，使得未連接的動粒產生足夠的“等待后期”信號來阻止細胞分裂；一旦完成染色體的配對，紡錘體蛋白便從動粒上釋放，SAC 被滅活，使細胞進入后期[3]。除了本文介 紹 的SAC 蛋 白Aurora B、CENP-E、Mad1、Bub1四種SAC 蛋白之外，還有另外一些檢驗點蛋白，比如BubR1、Mps1、Dynein 等，它們都在減數分裂及有絲分裂的紡錘體組裝及染色體排列中發揮了重要作用。影響減數分裂過程因素的不僅僅有SAC 蛋白，還有其他作用機制，比如環境、年齡、類泛素蛋白修飾分子（small ubiquitin-like modifier，SUMO）修飾[34]等。相關文獻表明[35]，年齡對卵母細胞質量有很大影響，高齡婦女發生染色體非整倍體的比率較高，與紡錘體微管的偏移和錯配密切相關。SUMO 化修飾是一種蛋白質翻譯后修飾途徑，參與了細胞增殖、分化、凋亡以及周期調控等眾多生理調控過程[36]。SUMO-1 可能在促進胞質分裂和維持第二次減數分裂紡錘體組裝檢查點方面發揮重要作用[34]。關于SUMO 修飾對減數分裂過程的影響、甚至導致非整倍體的具體分子機制還有待進一步的研究?？傊?，減數分裂這一過程需要多方面協同作用，正確認識及研究SAC 蛋白的檢測機制，對防止減數分裂染色體排列或分離異常及防止非整倍體的發生具有重要的意義。

目前，關于紡錘體檢查點蛋白在卵母細胞減數分裂過程的作用研究取得了一定的進展，但是關于紡錘體裝配機理及途徑，SAC 是如何準確監測及調節染色體運動、 各種SAC 蛋白又是如何協同作用來保證減數分裂正常進行的證據仍比較有限，有待于更進一步的研究。相信隨著生物學技術的進步，上述未能準確闡述的過程和機制定會得到完善，從而為減數分裂異常導致的非整體的發生及治療提供理論依據。