抗抑郁新藥-參味寧郁片對大鼠慢性應激模型及小鼠懸尾模型的抗抑郁作用研究

王雅欣 郭姍姍 高英杰 圖婭 崔曉蘭

摘要?目的：研究抗抑郁癥中藥新藥-參味寧郁片對慢性應激抑郁模型大鼠及小鼠懸尾抑郁模型的抗抑郁作用。方法：大鼠慢性應激模型：除正常組外，其余各組給予相應的慢性應激，并在造模前1 h灌胃給藥，共持續21 d。實驗前后通過體質量變化、糖水實驗、自發活動開場實驗測試，觀察各組大鼠相應指標的評分變化。采用放射免疫測定法檢測相關激素水平。小鼠懸尾抑郁模型：連續給藥7 d后用小鼠自主活動記錄儀記錄活動次數，再將小鼠懸尾后記錄小鼠不動時間，探究各給藥組對小鼠懸尾不動時間的影響。結果：慢性應激抑郁模型：在造模21 d后，與正常組比較，模型組大鼠在體質量、糖水偏好指數、水平及垂直運動評分等方面均顯著降低（P<0.05），參味寧郁片低劑量組在糖水實驗、水平及垂直運動評分與模型組比較差異均有統計學意義（均P<0.05）。此外，參味寧郁片3個劑量組均可有效降低慢性應激模型大鼠CRF的含量，低劑量組可顯著降低模型大鼠的ACTH水平（P<0.05）。小鼠懸尾抑郁模型：各給藥組小鼠懸尾后的不動時間與模型組比較差異均有統計學意義（均P<0.05）。結論：抗抑郁癥中藥新藥-參味寧郁片對慢性應激抑郁模型及小鼠懸尾抑郁模型均具有一定的抗抑郁作用。

關鍵詞?抑郁癥;大鼠慢性應激模型;小鼠懸尾模型;自發活動開場實驗;糖水偏好;放射免疫測定;參味寧郁片

Abstract?Objective：To investigate the antidepressant effect of Shenwei Ningyu Pills，a new anti-depression Chinese medicial，on the chronic stress depression model with rat and mouse tails suspended.Methods：Chronic Stress Model in Rats：except for the normal control group，rats in other groups were given the corresponding chronic stress，and given by gavage 1 h before modeling，for a total of 21 d.The changes of each index before and after the experiment were observed through body weight change，sugar water test and open field test.The levels of related hormones were detected by radioimmunoassay.Mouse suspended tail depression model：After continuous administration for seven days，the activity times were recorded with the mouse automatic activity recorder，and then the mouse fixed time was recorded after tail suspension，to explore the effects of each administration group on the suspended tail fixed time of mice.Results：Chronic stress depression model：Twenty-one days after modeling，compared with the normal group，rats in the model group exhibited significantly reduced body weight，sucrose preference index，and horizontal and vertical motor scores （P<0.05）.Compared with the model group，the low-dose Shenwei Ningyu Pills group had significant differences in the sugar water test，horizontal and vertical movement scores （Ps<0.05）.In addition，all three dose groups of Shenwei Ningyu Pills could effectively reduce the content of CRF in chronic stress model rats，and the low dose group could significantly reduce the ACTH level in model rats （P<0.05）.Mouse suspended tail depression model：The immobility time after tail suspension in each administration group was significantly different from that in the model group （Ps<0.05）.Conclusion：Shenwei Ningyu Pills，a new anti-depression Chinese medicinal，has a certain anti-depression effect on both the chronic stress depression model and the mouse suspended tail depression model.

Keywords?Depression; Chronic Stress Model in Rats; Mouse suspended tail model; Open field experiment;Sugar water preference; Radioimmunoassay; Shenweiningyu Pills

中圖分類號：R285.5文獻標識碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2021.22.011

抑郁癥是一種臨床表現多樣的精神類疾病，以顯著且持續性情緒低落為主要癥狀[1]，又稱為抑郁障礙，是一種高患病率、高致殘率和高病死率的常見精神疾病[2-3]，并伴有認知、行為和社會功能異常等，嚴重者會有自殺傾向[4]。全球有近19%的人患有抑郁癥，其中約有3億人患有重度抑郁癥[5]，重度抑郁癥將會嚴重降低患者生命質量，帶來極大的經濟負擔[6]。2008年，WHO將重度抑郁癥列為全球疾病負擔的第三大原因[7]。抑郁癥也是多種疾病的并發癥之一，如產后抑郁癥、糖尿病抑郁綜合征、腦卒中抑郁癥等相關疾病。

抑郁癥的發病機制較為復雜，目前針對抑郁癥的診斷主要以臨床表現為主，國內外對于抑郁癥生物標志物的研究主要集中于炎癥介質、神經營養因子、下丘腦-垂體-腎上腺激素（HPA）軸等方面[8]，本實驗證實了中藥抗抑郁新藥-參味寧郁片能夠使慢性應激抑郁模型大鼠及懸尾抑郁模型小鼠的行為學得到改善，并且能夠降低抑郁模型大鼠下丘腦-垂體-腎上腺（HPA）軸中關鍵因子的含量水平，以期對中藥臨床抗抑郁研究提供更多實驗依據。

1?材料與方法

1.1?材料

1.1.1?動物?本實驗納入成年雄性SD大鼠60只，6周齡，體質量160～180 g;昆明種小鼠雄性60只，3～4周齡，體質量13～15 g。實驗動物由北京維通利華公司實驗動物中心提供[合格證號：scxk（京）2002-0003]。動物自由攝食飲水，光照控制實驗室晝夜交替，室溫18～26 ℃，濕度（55±2）%。本實驗獲得中國中醫科學院中藥研究所實驗動物倫理委員會批準。

1.1.2?藥物?1）受試藥物：參味寧郁片（實驗采用壓片前的藥粉），含7.0 g生藥/g藥粉，性狀：淺棕色粉末，由中國中醫研究院中藥研究所劑型室提供，批號：030802。2）陽性對照：百憂解，英國禮來公司產品，批號（98）衛藥準字J-23號。臨床適應證：抑郁癥。劑型：膠囊。用法用量：20～40 mg/d。

1.1.3?試劑與儀器?促腎上腺皮質激素釋放激素放射免疫檢測試劑盒（批號：131116）、促腎上腺皮質激素放射免疫檢測試劑盒（批號：131118）、腎上腺皮質激素放射免疫檢測試劑盒（批號：131119）均購自北京華英生物技術診斷試劑公司。高速水平震蕩儀（上海中生生物科技有限公司，型號：HY-4）;生理記錄系統（成都儀器廠，型號：Rm6240B/C）;小鼠觀察箱（24 cm×15 cm×15 cm，自制）;小鼠懸尾平衡支架（自制）;16管放射免疫γ計數器（眾成機電技術公司，型號：DFM-96）。

1.2?方法

1.2.1?分組與模型制備?將實驗動物進行適應性喂養，并在實驗前用自發活動開場實驗（Open-Field）對所有動物進行評分篩選。采用隨機數字表法將大鼠及小鼠分為正常組、模型對照組、百優解組、參味寧郁片高劑量、中劑量組和低劑量組，每組10只。本實驗中所有操作均遵循NIH及北京市實驗動物倫理委員會的規定。1）大鼠慢性應激抑郁模型：正常組和模型組給予生理鹽水，其余各給藥組于每天實驗前1 h按1 mL/100 g灌胃給藥，1次/d。給藥1 h后，除正常組外，其余各組給予相應的慢性應激。包括：高速水平震蕩45 min;強迫游泳（15 ℃）5 min;足底電擊3 min（36 V，時程5 s，間隔5 s/次）;夾尾（距尾根1 cm）3 min;禁水24 h;禁食24 h;溫箱5 min（45 ℃）;晝夜顛倒24 h。每天選擇1種進行1次，連續21 d，平均每種刺激1～3次。見表1。2）小鼠懸尾抑郁模型：在“行為絕望”動物抑郁模型中最突出的是小鼠懸尾模型。懸尾的小鼠為克服不正常的體位而掙扎活動，但活動一定時間后，出現間斷性不動，顯示“失望”狀態，這種狀態被稱為“行為絕望”。各組實驗動物測定完自主活動后，立即用黏膏條將小鼠尾在距尾尖2 cm粘在一側懸棒的下端，另一側懸掛砝碼，調整兩側平衡，記錄時支架的動物端懸線穿過50 g張力換能器，用支架上的游標使動物端加重5 g再重新調平衡（作為前負荷），換能器連接到具有Rm6240B/C生理實驗系統的電腦上。按該系統指示適應1 min后記錄5 min的結果，將不動時間段所包括的格數（個）換算成時間（s）。

1.2.2?給藥方法?1）劑量設計。參味寧郁片：人臨床用量為34 g生藥/（60 kg·d），即0.57 g/（kg·d），換算成小鼠用量即為3、6、12 g生藥/（kg·d），大鼠用量即為1.5、3、6 g生藥/（kg·d），均分別相當于人臨床用量的1/2倍、等倍和2倍。百憂解：臨床人用量為40 mg/（60 kg·d），實驗時小鼠用量為5.2 mg/（kg·d）;大鼠用量為2.6 mg/（kg·d）;均為臨床等效用藥量。2）給藥方式：小鼠按0.2 mL/10 g灌胃給藥;大鼠按1 mL/100 g灌胃給藥。

1.2.3?大鼠慢性應激抑郁模型檢測指標與方法

1.2.3.1?行為學觀察?1）體質量測量：本實驗分別于開始前1天（0 day）、第21天（21 days）對大鼠進行體質量監測，比較不同時間點各組大鼠體質量變化情況。2）糖水偏好實驗：在實驗開始前，先訓練所有大鼠使其適應含1%蔗糖水。分別于實驗開始前1天、第7天、第14天和第21天進行糖水實驗，再計算大鼠的糖水偏好指數，比較分析各組大鼠在不同時間點糖水偏好指數的差異[9]。糖水偏好指數公式=（糖水消耗/總液體消耗）×100%。3）自發活動開場實驗：本實驗所用的自發活動開場實驗箱為高40 cm，長、寬均為80 cm的箱體，周壁、底面為黑色，底面由面積相等的25塊組成，用白線劃分。將大鼠置于敞箱底面的中心方格內以動物穿越底面的格數（四爪均進入的方格方可記數）為水平運動得分;以后肢直立次數（兩前爪騰空或攀附墻壁）為垂直運動得分。每只動物測定1次，測定時間為3 min/次。分別于實驗開始前1天（0 day）和第21天（21 days）進行測試，比較分析各組大鼠在不同時間點自發活動開場實驗測試的水平穿越格數和垂直豎立次數的差異。

1.2.3.2?指標檢測?1）取材方法：待各組實驗動物存活期滿后，于第22天經10%水合氯醛（0.35 mL/100 g）腹腔注射麻醉大鼠，斷頭取腦，取出下丘腦、垂體、腎上腺分別稱重。2）測定方法：通過放免法測定下丘腦中促腎上腺皮質激素釋放因子（CRF）、垂體中促腎上腺皮質激素（ACTH）、腎上腺中皮質醇（CORT）的含量。

1.2.4?小鼠懸尾抑郁模型檢測指標與方法

行為學觀察。實驗前1周將小鼠分籠飼養，室溫（20±1）℃，自由飲食。各給藥組灌胃給藥，正常及模型組給予等體積生理鹽水，1次/d，連續7 d，第7天給藥后1 h，將單只小鼠放入小鼠自主活動記錄儀，適應1 min后，記錄5 min內的活動次數，作為自主活動的指標，隨后立即用粘膏條將小鼠尾在距尾尖2 cm粘在一側懸棒的下端，另一側懸掛砝碼，調整兩側平衡，記錄時支架的動物端懸線穿過50 g張力換能器，用支架上的游標使動物端加重5 g再重新調平衡（作為前負荷），換能器連接到具有Rm6240B/C生理實驗系統的電腦上。按該系統指示適應1 min后記錄5 min的結果，將不動時間段所包括的格數（個）換算成時間（s）。

1.3?統計學方法?采用SPSS 25.0統計軟件進行數據分析，實驗結果均以平均值±標準誤（±s）表示。對數據進行正態性檢驗，方差齊用t檢驗;方差不齊，用χ2檢驗。以P<0.05為差異有統計學意義。

2?結果

2.1?大鼠慢性應激抑郁模型

2.1.1?行為學實驗結果?;1）體質量測量：造模前各組大鼠體質量無顯著差異。造模21 d后，模型組體質量顯著低于正常組（P<0.05）;參味寧郁片高、中劑量組與正常組比較差異有統計學意義（P<0.05）。見表2。2）糖水實驗：正常組糖水攝入量隨時間的增加呈逐漸上升趨勢;模型組的糖水攝入量從造模第7天開始，顯著低于正常組，造模21 d后仍保持在低水平狀態，與正常組比較差異有統計學意義（P<0.05）;參味寧郁片低劑量組的糖水攝入量隨時間的增加呈逐漸上升趨勢，與模型組比較差異有統計學意義（P<0.05）。見表3。3）自發活動開場實驗：造模前，各組大鼠自發活動開場實驗的水平運動和垂直運動得分差異無統學意義。在造模21 d后，模型組的水平運動得分顯著低于正常組（P<0.05），參味寧郁片高劑量組、中劑量組的水平運動得分高于模型組，但差異無統計學意義，低劑量組的水平運動得分顯著高于模型組（P<0.05）。模型組自發活動開場實驗的垂直運動得分顯著低于正常組（P<0.05），參味寧郁片高劑量組、中劑量組的垂直運動得分高于模型組，但差異無統計學意義，低劑量組的垂直運動得分顯著高于模型組（P<0.05）。見表4。

2.1.2?指標檢測結果?與正常組比較，慢性應激模型大鼠的促腎上腺皮質激素釋放因子（CRF）、促腎上腺皮質激素（ACTH）及皮質醇（CORT）均有明顯升高，且CORT與正常組比較差異有統計學意義（P<0.01）。參味寧郁片3個劑量組均可有效降低慢性應激模型大鼠CRF的含量，與陽性藥百憂解相比效果更好，本藥低劑量組可顯著降低模型大鼠的ACTH水平（P<0.05）。見表5。

2.2?小鼠懸尾抑郁模型?參味寧郁片各劑量組對小鼠自主活動并無明顯影響。各給藥組小鼠在懸尾后的不動時間與模型組比較均有明顯縮短，且與模型組比較，差異有統計學意義（P<0.05）。見表6。

3?討論

近年來，全球范圍內抑郁癥的患病概率持續上升，且自殺率顯著增加[10]，已經嚴重危害到人類健康及世界經濟的發展[11]。因此針對抑郁癥的研究從未止步，并且研發出諸多與人類抑郁癥發病機制相似的動物抑郁癥模型[12]，只有在可靠的動物模型上才能探索更多治療抑郁癥的特效藥。

本研究中涉及的2種動物抑郁模型均為經典且常見的抑郁模型。小鼠懸尾抑郁模型屬于典型的“行為絕望”模型，是由研究者Steru等[13]于1985年提出，屬于一種溫和刺激致抑郁模型。慢性應激抑郁模型因其對動物身體傷害較小且多種刺激方式隨機出現可克服動物的適應反應而深受研究者們的青睞[14]，快感缺乏是抑郁癥患者的基本癥狀之一，該模型通過測量實驗動物消耗的糖水量來驗證是否造模成功[15]。而抗抑郁藥可以增加該抑郁模型的糖水攝入量。

有研究證實抑郁癥的神經內分泌系統的功能改變主要以下丘腦-垂體-腎上腺（HPA）軸功能亢進為主[16]，具體表現為：促腎上腺皮質素釋放激素水平升高、促腎上腺皮質激素分泌增強、皮質醇水平增高，晝夜分泌節律改變等[17]。HPA軸可分泌促腎上腺皮質激素（ACTH）、皮質醇（CORT）等，這些指標的水平變化通常作為應激程度的指標[18]。樊蔚虹等[19]研究發現慢性束縛大鼠血漿中ACTH、血清CORT含量水平明顯升高，大鼠海馬損傷對HPA軸負反饋調節作用減弱，HPA軸功能產生亢進，用藥干預后可明顯降低大鼠血漿ACTH、血清CORT水平，對HPA軸功能亢進也具有顯著調節作用。

本研究所用藥物為中藥抗抑郁新藥-參味寧郁片，該藥在2005年作為國內首個準入臨床試驗的治療抑郁癥的純中藥小復方制劑（6.1類）獲得CFDA臨床研究批件。臨床試驗證實該藥對于氣陰兩虛型抑郁癥有顯著療效，且具有較好的安全性和有效性[20]。參味寧郁片還能夠顯著逆轉慢性束縛應激誘導海馬中TLR4、MyD88蛋白上調表達水平，并且可對以模式識別受體TLR4信號通路介導的免疫炎性激活進行廣泛調節[21]。

本實驗采用2種經典的抑郁癥動物模型，證實了參味寧郁片能夠明顯改善慢性應激模型大鼠的糖水偏好指數、水平及垂直運動評分，并且可有效降低該模型大鼠CRF、ACTH及CORT的含量。在小鼠懸尾抑郁模型上該藥能夠顯著縮短懸尾后的不動時間。充分證實了抗抑郁癥中藥新藥-參味寧郁片對慢性應激大鼠抑郁模型及小鼠懸尾抑郁模型均具有一定的治療作用，以期為今后抑郁癥的臨床研究提供一定的實驗依據[22]。

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（2021-04-12收稿?責任編輯：王明）