雌激素通過氯通道影響骨質疏松的研究進展

方煥坤 鄧志欽 段莉 李文翠 王大平*

1.汕頭大學醫學院，廣東 汕頭 515041

2.深圳市第二人民醫院骨科，廣東 深圳 518035

1 成骨細胞-破骨細胞代謝平衡與骨質疏松

1.1 骨質疏松癥的定義和流行病調查情況

2001年，美國國立衛生研究院骨質疏松委員會發表了一份骨質疏松癥(osteoporosis，OP)共識的定義：骨質疏松癥為骨骼生長失調，有損害骨骼強度且誘發骨折風險的疾病，其典型特征是骨皮質變薄、骨小梁之間失去連接[1]。世界衛生組織定義骨質疏松癥為一種全身代謝性骨病，其特點是當骨量減少和骨組織的微細結構受損時，骨的脆性增加，易于發生骨折。國際骨質疏松基金會預測絕經后女性中約有1/3罹患骨折，而50歲以上的男性約有1/5罹患骨折[2]。隨著人口老齡化的加劇，骨質疏松癥已逐漸成為50歲以上群體的一個全球性健康問題，我國老年人比例不斷上升，骨質疏松癥已經成為社會面臨的嚴重挑戰[3]。我國50歲以上人群骨質疏松癥患病率為女性20.7%，男性14.4%，且骨質疏松性骨折發病率也逐年攀升，女性高達24.43%，男性達15.58%[4]。骨質疏松癥患者結局常常是脆性骨折甚至殘疾，這都將給家庭及社會帶來巨大的經濟負擔，且在接下來幾十年中形勢愈加嚴峻。據統計，2010年約有233萬例骨質疏松性骨折發生，花費9.45億美元。女性骨折的發生率約為男性骨折的3倍，占總費用的76%，到2035年，骨質疏松癥相關骨折的年數量和費用將翻一番，到2050年將增加到599萬例骨折，花費254.3億美元[5]。由此看出，骨質疏松癥已經成為我國50歲以上人群的重要健康問題，中老年女性骨質疏松問題尤為嚴重。

1.2 成骨細胞-破骨細胞代謝平衡與骨質疏松

成骨細胞(osteoblast，OB)和破骨細胞(osteoclast，OC)是骨重塑過程中的兩種主要細胞，協調OB與OC的生成與活性，能平衡骨的吸收與形成過程。已有研究表明，成骨細胞和破骨細胞可以通過直接的細胞-細胞接觸、細胞因子和細胞外基質相互作用、相互溝通。成骨細胞可通過多種途徑影響破骨細胞的形成、分化或凋亡，如OPG/RANKL/RA[6]。一旦上述骨吸收和骨形成之間的動態平衡被破壞，如女性更年期，骨量逐漸減少就會表現出來，骨骼內部結構空隙增加、骨骼機械強度漸進性減弱，最終導致骨折的易發[7]。

2 雌激素對骨質疏松的影響

2.1 雌激素對骨質疏松或絕經后骨質疏松癥的影響

雌激素調節成骨細胞和破骨細胞的活動，在調節骨代謝中起重要作用。絕經后，雌激素缺乏，抑制骨形成，使得骨髓擴張和骨內膜吸收導致骨丟失，骨強度降低[8]。研究表明，雌激素對維持骨吸收和骨形成的平衡具有著極其重要的作用，雌激素可以促進破骨細胞凋亡，從而抑制骨吸收，但這種促凋亡作用的分子機制尚不清楚。此外，雌激素抑制成骨細胞產生破骨細胞分化因子，并通過這種間接機制抑制破骨細胞的形成和骨吸收[9]。絕經后骨質疏松癥(postmenopausal osteoporosis，PMOP)又稱原發性骨質疏松癥(Ⅰ型骨質疏松)，是對老年婦女健康危害很大的常見病和多發病。其發病機制與雌激素耗竭有關，隨著年齡增長，雌激素耗竭會導致骨質流失加重。這種骨骼疾病模式包括普遍存在的骨小梁丟失和穿孔，使得椎體和橈骨遠端這類松質骨骨折風險增高[8]。雌激素可減少更年期引起的骨代謝加速，并可防止全身各骨骼部位的骨丟失。系統口服或經皮雌激素治療(estrogen therapy，ET)或雌激素加黃體酮治療(estrogen plus progestin therapy，EPT)對婦女保護的有益影響已被確立。不幸的是，雌激素治療增加了子宮內膜癌、中風、冠心病(coronary heart disease，CHD)和凝血栓塞事件的風險[10]。Kyunghee等[11]研究發現，RANKL通過誘導ERK1和ERK2磷酸化，促進破骨細胞分化。實驗表明，雌激素下降與OPG/RANKL比值升高有關，雌激素在絕經早期通過OPG/RANKL途徑抑制破骨細胞，從而改善骨丟失，且隨著雌激素劑量的增加，局部骨血管的形成增加，提示雌激素可能通過血管生成影響骨質疏松癥[12]。此外，腫瘤壞死因子α(TNF-α)在絕經后骨質疏松癥的發病機制中起著重要作用，它可以抑制間充質干細胞(MSC)成骨分化從而導致骨形成受損[13]。雌激素存在時，可促進成骨細胞周期進程加速細胞增殖，有報道指出雌激素可影響大鼠成骨細胞分泌生長因子-β(TGF-β)及類胰島素生長因子-I(IGF-I)，TGF-β調節早期骨髓基質細胞向成熟成骨細胞分化，IGF-I信號是生長激素誘導骨生長的主要介質，IGF-I和配體-受體(efn Eph)信號轉導相互作用，調節骨骼生長和維持[14-15]。另外，酪氨酸激酶-2 (Pyk2)對骨形成具有重要作用，缺乏Pyk2的雌鼠(Pyk2-ko)骨量增加，骨形成率增加，pyk2的缺失使雌激素刺激OB的分化和礦化[16]。

2.2 雌激素受體在絕經后骨質疏松癥中的作用

雌激素受體(ER)介導大部分的雌激素反應，ER屬甾體激素類超家族成員，是一類與配體結合激活的核轉錄因子。經典的ER信號轉導途徑：雌激素通過直接與核內雌激素α或β受體結合，直接激活下游靶基因的活化。雌激素α和β受體(ERα和ERβ)在成骨細胞和破骨細胞均有表達，提示雌激素可通過結合表達在成骨細胞和破骨細胞上的受體從而發揮作用[17]。ERα在成骨細胞祖細胞中可通過調節骨膜骨形成的增加起關鍵作用。此外，ERα可刺激成骨細胞的信號維持松質骨骨量。但目前，ERα信號在成熟成骨細胞保持松質骨質量的分子機制仍不清楚[9]。

3 氯離子通道在調節成骨細胞中的重要作用和機制

3.1 氯通道的一般生理功能及在調節骨形成中的作用

氯離子具有重要的生物學功能，是機體內環境含量最豐富的陰離子。氯通道細分為5個氯離子通道家族：配體門控陰離子通道、CFTR、ClCs、bestrophins和anoctamins[18]。ClC-3氯離子通道是一種電壓門控型離子通道，在哺乳動物細胞中廣泛表達，其作用主要有維持細胞體積平衡、調節細胞興奮性、離子穩態、溶酶體酸化和跨膜轉運相關。破骨細胞通過質子泵分泌氫離子，氯離子通過靠近鈣化骨的底面細胞膜上的氯離子通道，溶解骨中的礦物質，而且ClC-3可通過成骨細胞促進新骨的生長[19]。氯離子交換器ClC-3和ClC-5在活性成骨細胞的表面高表達[20]。盧曉琳等[21]通過研究不同ClC-3氯離子通道表達水平對成骨相關基因的影響表明，成骨細胞中ClC-3氯離子通道的表達有助于成骨細胞對PTH的刺激，從而介導成骨細胞的分化[21]。ClC-3氯通道蛋白表達水平增加，可以上調下游Runx2基因表達，從而促進成骨分化[22]。此外，Cl--H+逆向轉運蛋白ClC-3和ClC-5還能驅動成骨細胞的礦化和調節精細骨結構[23]。有研究表明，C1C-3過表達導致小鼠的皮質骨和松質骨骨量減少，骨結構變差，提示C1C-3可能參與了骨形成或骨吸收[24]。沒有ClC-3和ClC-5，成骨細胞無法在體外礦化，Clcn3/Clcn5雙基因敲除對動物來說可能是致命的[25]。

3.2 氯離子通道蛋白在骨形成信號調節通路中的作用

Brum等[26]研究發現，在成骨細胞分化過程中人類間充質干細胞(hMSCs)CLIC3基因表達強烈上調，而脂肪細胞中的CLIC3表達下降，與成骨細胞的表達相反。當利用慢病毒轉導使間充質干細胞CLIC3過表達后導致基質礦化增加60%，而敲除CLIC3基因后細胞基質礦化降低了78%～88%。

4 氯離子通道在調節破骨細胞中的重要作用和機制

骨骼也是時刻都在進行著物質代謝，成骨細胞和破骨細胞是骨骼不斷新陳代謝的基礎。正常生理條件下，破骨細胞與成骨細胞相互協調，通過蝕骨和成骨的動態平衡機制，維持著骨骼的正常代謝和機體的正常運作。RANKL是腫瘤壞死因子(TNF)超家族成員之一，由成骨細胞和骨細胞表達。RANKL的受體RANK存在于破骨細胞和破骨細胞前體上，當RANKL與RANK結合時，破骨細胞分化被激活[27]。骨細胞還分泌RANKL誘餌受體骨保護素(OPG)，OPG結合RANKL與RANK競爭，從而抑制破骨細胞分化[28]。OPG/RANKL比值受雌激素調節，其比值下降可側面增強RANKL-RANK的相互作用，RANKL刺激破骨細胞前體退出細胞周期并最終分化，所以雌激素水平下降破骨細胞被大量活化[29]。氯通道的開放是破骨細胞骨吸收的關鍵步驟。當破骨細胞被活化，活化后的破骨細胞會貼附靠近在骨骼表面，大量聚集質子泵和氯通道，當質子泵與氯通道被激活時，則大量分泌 HCl至吸收腔面，調節骨吸收[30]。

5 雌激素、雌激素受體和氯離子通道在骨代謝中的作用

近年研究發現雌激素通過受體依賴性或非受體依賴性兩種方式作用于離子通道。成骨細胞的成骨功能也受雌激素的調節。有研究表明，當成骨細胞中I型電壓門控型鈣離子通道被激活后，可以減少卵巢切除(ovx)骨質疏松小鼠模型中的骨丟失；在使用鈣通道阻滯劑后，成骨細胞標志物的轉錄顯著下降，表明信號通過內源性鈣離子通道調節骨形成[31]。鈣通道的表達可增強骨小梁的生長，防止雌激素缺乏引起的骨丟失。雌激素與離子通道在細胞功能表達上關系密切，其中氯離子通道是雌激素調控細胞功能的重要途徑。ClC-3已被證實參與細胞遷移，雌激素可激活ClC-3基因的表達，促進其翻譯，促進細胞生長[32]。ClC家族中的Cl-通道在成骨細胞中表達并且與骨生理學和病理學相關，通過研究雌激素對MC3T3-E1成骨細胞氯通道的作用，發現17β-雌二醇可誘導成骨細胞產生一個氯電流，且該電流可被雌激素受體拮抗劑所抑制，雌激素可通過細胞膜表面的ERα激活氯通道，表明ClC-3氯通道可能是雌激素調控成骨細胞活性的靶點之一[33]。另外，17β雌二醇可提高I型膠原蛋白表達和堿性磷酸酶活性，促進氯通道蛋白表達；當使用氯通道阻滯劑沉默氯離子通道表達后，阻止了成骨細胞分化，提示雌激素可通過激活ClC-3氯離子通道調節骨形成，增強成骨細胞的成骨分化[34]。

6 Wnt信號通路

在生理條件下，成骨和破骨在多種細胞參與和信號途徑調解下達到動態平衡。Wnt配體通過β-連環蛋白依賴性和非依賴性信號傳導在各種器官的發育和穩態中發揮核心作用。自從發現低密度脂蛋白受體相關蛋白5(Lrp5)基因突變與人類交替之間的因果關系以來，Wnt/β-catenin信號在骨量中的關鍵作用已經通過大量研究確定。Wnt蛋白在細胞分化前可抑制成骨細胞前體細胞的凋亡，從而促進間充質干細胞向成骨細胞的分化[35]。Wnt/β-連環蛋白信號傳導的激活誘導促進成骨細胞分化的轉錄因子osterix的表達。此外，該信號傳導誘導骨保護素的表達，骨保護素是成骨細胞譜系細胞中的破骨細胞抑制因子，以防止骨吸收。Wnt信號對正常骨形成是必不可少的。Wnt受體Lrp5的失活突變導致骨質疏松性假性膠質瘤，而激活突變導致高骨量。Wnt1功能缺失突變可導致成骨不全和早發型骨質疏松癥。實驗表明Wnt1是破骨細胞進行骨吸收的來源之一，且Wnt1可能有助于成骨細胞分化與骨吸收位點的耦合[36]。最近的研究也表明，Wnt5a可增強破骨細胞的形成。相反，Wnt16通過β-連環蛋白非依賴性信號傳導抑制破骨細胞形成[37]。成骨細胞及其前體、骨細胞和破骨細胞能夠分泌各種Wnt配體，參與骨重建，Wnt /β-catenin信號通路直接提高成骨細胞分化和骨形成，而間接地抑制破骨細胞分化和骨吸收，Wnt通路的激活還會導致細胞外基質成分如纖維連接蛋白或膠原的分泌增加，這些成分可以改變骨生化和結構特性[38]。Wnt信號通路對骨調節發揮著重要的作用，但其分子機制目前尚不清楚，可能與氯通道開放有關。

綜上所述，骨質疏松癥是一類常見的代謝性疾病，在人群的發病率逐年上升，尤其是面臨絕經期的中老年女性，嚴重影響社會經濟及健康。絕經后骨質疏松是老年女性常見病，目前仍然沒有改善絕經后婦女骨質疏松癥的安全有效的藥物。雌激素調節成骨細胞和破骨細胞的活動，在調節骨代謝中起重要作用，而氯離子通道與骨代謝密切相關，不僅可以通過破骨細胞溶解骨中的礦物質，調節骨吸收，而且通過成骨細胞促進新骨的生長。雌激素可激活成骨細胞的氯電流，促進破骨細胞凋亡，雌激素與氯離子通道的相關機制可能是：雌激素通過細胞表面雌激素受體，激活氯通道，通過Wnt信號途徑，抑制破骨細胞形成并促進成骨細胞表達，從而調節骨代謝。但Wnt信號途徑如何影響骨調節，其分子機制尚不清楚，有待進一步的科學研究。通過研究及探討氯通道調控骨形成的機制，有望為離子通道型抗骨質疏松癥藥物的研發提供理論基礎，研發新型抗骨質疏松藥物。