不同來源外泌體在原發性骨質疏松中的研究進展

唐彬彬 袁一峰 王申 余陽 陳天鵬 劉康 吳連國 史曉林*

1.浙江中醫藥大學附屬第二醫院，浙江 杭州 310005

2.浙江中醫藥大學，浙江 杭州 310053

原發性骨質疏松(primary osteoporosis，POP)包括絕經后骨質疏松和老年性骨質疏松。雌激素缺乏是絕經后骨質疏松的誘因，而老年性骨質疏松則與年齡相關。從骨細胞代謝來看，POP是由于骨重建失衡，導致骨組織微結構改變、骨量降低，以致骨脆性增加，易發生骨折的全身性骨病。2018年，國家衛生健康委發布稱骨質疏松癥(osteoporosis，OP)已經成為我國50歲以上人群的重要健康問題，中老年女性骨質疏松問題尤為嚴重[1]。50歲以上人群POP患病率為19.2%，其中女性為32.1%；65歲以上人群POP患病率達到32.0%，其中男性為10.7%，女性為51.6%[1]。因此，開展治療和預防骨質疏松癥的相關研究是十分必要的。

POP是由多種基因-環境因素等微小作用積累的共同結果[2]。當前，在細胞-因子層面研究如何防治骨質疏松癥的報道較多，尤其是對細胞來源外泌體(exosomes)的研究。外泌體是一類由脂質雙分子層構成，大小30～140 nm的細胞外囊泡，包含多種蛋白質、RNA、DNA和可以在細胞之間轉移的生物活性脂質[3-4]。外泌體不僅可被不同類型的健康或患病細胞釋放，也可由體外培養的細胞分泌，包括各種干細胞、骨細胞、內皮細胞、免疫細胞、腫瘤細胞等，也存在各種體液中，包括血液、唾液、尿液和母乳。研究表明，外泌體可參與各種疾病的發展和進程。在骨生物中的作用體現在骨組織損傷退變、骨質疏松、成骨不全及骨折不愈合等[5-6]。骨質疏松方面，外泌體的作用突出，已作為治療OP的新方法，具有極大的治療潛力[7-8]。近年來研究發現，不同細胞來源外泌體可調節骨代謝[9-11]，參與骨重建改善POP[12-13]。而外泌體的功能的機制與microRNA(miRNA)[10，14-16]、long noncoding RNAs(lncRNA)[17-18]有關。本文將就不同來源外泌體在POP的研究進展進行綜述。

1 間充質干細胞來源外泌體

間充質干細胞(mesenchymal stem cells，MSCs)從成人組織中分離，具有廣泛的增殖和分化成各種細胞譜系的能力[19]。近年來，在組織修復中，MSC的治療機制發生了從基于細胞分化和置換轉變為基于細胞分泌和旁分泌信號[20]。在廣泛的營養因子中，MSC來源外泌體在包括骨缺損和骨質疏松在內的多種損傷或疾病適應證中具有治療效果[19，21-22]。一項包含23項動物研究的系統回顧發現MSC來源外泌體促進新骨形成，改善骨形態，抑制骨衰老，并對成骨細胞存活、增殖和遷移，形成產生了積極影響[20]。關于MSC來源外泌體的促成骨機制認為與外泌體差異表達的miRNA有關。miRNA參與并豐富了成骨分化的調控途徑，比如“Wnt信號傳導途徑”和“內吞作用(endocytosis)”[23]。

1.1 骨髓間充質干細胞來源外泌體

骨髓間充質干細胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)是指從人體或動物骨髓中分離出來的一類干細胞，具有促進骨愈合、骨細胞生長、骨形成的重要作用。

BMSCs來源外泌體可抑制細胞凋亡信號通路，促進成骨細胞增殖，改善POP[24-28]。研究發現外泌體干預顯著降低了成骨細胞中凋亡相關的促凋亡蛋白細胞色素C和凋亡蛋白酶caspase3的表達，增強了細胞活力，并減弱了細胞凋亡[26]。采用BMSCs外泌體抑制Bax/Bcl-2/Caspase凋亡信號通路，通過干預卵巢切除(ovariectomized，OVX)小鼠后，發現血清骨鈣素、骨礦物質密度和體積均顯著高于對照組[27]。Zhao等[25]與Xie等[24]報道基于MAPK通路，BMSCs來源外泌體可以促進人成骨細胞系-hFOB1.19細胞增殖和分化，并下調相關凋亡基因。機制研究揭示了BMSCs外泌體中的miRNA作用較大。MiR-150-3p具有促進POP中成骨細胞的增殖和分化[29]。MiR-29a可以被轉運到人臍靜脈內皮細胞調節血管生成及成骨，成為治療POP的潛在靶標[30]。BMSCs外泌體中lncRNA-MALAT1(轉移相關的肺腺癌轉錄因子1)可結合miR-34c以促進SATB2的表達，增強OVX小鼠成骨細胞活性，SATB2具有促進成骨分化的作用[31]。然而，miR-21靶向作用SMAD7抑制了相關成骨因子的表達，加重POP[32-33]。體內實驗發現老齡大鼠BMSCs中miR-31a-5p顯著增加，抑制成骨細胞分化[34]。上述研究說明BMSCs源性外泌體在原發性骨質疏松癥具有研究意義。

中醫學認為原發性骨質疏松具有腎虛、骨痿、髓減的病機特點，“腎主骨生髓”是防治POP的核心理論，符合BMSCs源性外泌體的作用機制，這也為中醫學治療骨質疏松癥提供新思路[35]。

1.2 人臍帶間充質干細胞來源外泌體

研究表明，人臍帶間充質干細胞(human umbilical cord mesenchymal stem cells，HUCMSCs)來源外泌體具有刺激骨形成，抑制骨吸收的雙向調控作用，能通過miRNA介導抑制BMSCs凋亡，減少骨髓內脂肪累積，實現減少骨丟失和維持骨強度的作用[36-38]。研究發現HUCMSCs來源外泌體內富含成骨蛋白CLEC11 A (C-type lectin domain family 11, member A)，CLEC11 A可以影響破骨細胞形成，調節骨代謝[37]。MiR-1263可結合Mob1-3'UTR，可激活Hippo通路[39]，最終抑制BMSCs凋亡，預防OP[38]。MiR-3960可促進BMSCs的成骨作用，減少年齡相關OP的骨流失[36]。

1.3 其他干細胞來源外泌體

2017年，Zhu等[40]報道小鼠脂肪干細胞來源外泌體減少骨細胞的凋亡。近兩年，報道人尿液干細胞和人乳牙干細胞具有相似的作用。Yang等[41]研究發現人尿來源干細胞(urine-derived stem cells，USCs)源性外泌體后可以緩解骨質疏松小鼠骨丟失，保持骨強度。外泌體內富含CTHRC1(collagen triple-helix repeat containing 1)及骨保護素，是促進成骨細胞分化和抑制破骨細胞分化所必需的。由于USCs來源外泌體具有可無創性采集，不受供體年齡、性別、健康狀況影響的優點，有望成為治療POP的新制劑。Sonoda等[42]研究發現人脫落乳牙(human exfoliated deciduous teeth，SHED)釋放細胞外外泌體，靶向干預BMSC的端粒酶活性，并將處理后BMSC移植入OVX小鼠背部皮膚，可促進骨質疏松小鼠的成骨能力。上述研究均提示人體干細胞來源外泌體具有促進成骨分化的作用，對治療POP表現出新的機制和作用。

2 破骨細胞來源外泌體

破骨細胞(osteoclast，OC)來源外泌體具有促進OC分化，調控破骨和成骨細胞交流，調節骨代謝的作用[43-44]。研究發現OC來源的外泌體可通過傳遞 miR-214-3p 至成骨細胞中抑制成骨細胞分化，miR-214-3p 高表達的轉基因小鼠骨形成受到抑制[45]。Zhu等[46]報道采用磁性羥基磷灰石(MHA)支架可以降低OB攝取外泌體的效率，從而促進成骨細胞增殖。近幾年相關研究發現微重力環境誘導的骨質疏松模型研OC外泌體內的miRNA表達異常，可通過Wnt/β-catenin信號通路，抑制成骨分化[47-48]。但對POP的研究報道較少，今后可作為一個新的研究方向。

3 成骨細胞來源外泌體

成骨細胞(osteoblasts，OB)來源外泌體也具有抗POP的作用。研究報道來自中晚期階段OB的外泌體可顯著促進BMSCs的成骨分化，并改善OVX小鼠的骨質疏松癥，可運用于骨組織工程研究[49]。Tang等[50]報道成骨細胞來源外泌體miR-433-3p可抑制90%的DKK1蛋白表達，明顯降低DKK1對Wnt/β-catenin的抑制作用，來促進OVX小鼠成骨細胞分化而發揮作用。然而，報道在OVX小鼠體內注射OB和OB來源外泌體后發現，注射OB具有更強的成骨能力[51]。因此，目前關于OB來源外泌體的抗POP作用仍在一定的爭議，需要進一步研究發現。

4 肌細胞來源外泌體

近年來，肌肉骨骼被認為是內分泌器官影響各自的功能，用肌骨“crosstalk”形容它們的關聯。研究發現這種關聯是通過肌動蛋白和骨衍生因子實現的[52]，可作為用于骨質疏松癥和肌少癥的新療法。Takafuji等[53]對肌骨“crosstalk”的內在機制進行探究，發現C2C12成肌細胞可分泌外泌體抑制破骨細胞分化，接著通過miRNA測序發現C2C12成肌細胞miR-196a-5p表達較高，具有抑制破骨細胞正常功能，增強成骨細胞功能的作用[54]。但是，C2C12成肌細胞外泌體miR-34a則增加了BMSCs的凋亡[55]。基于骨骼肌來源外泌體內在機制，也符合中醫認為老年性骨質疏松是由于脾腎失司致肌肉骨骼失調失養引起的[56]。上述研究表明成肌細胞外泌體是進行肌骨相互作用的關鍵因素，是治療POP的潛在制劑。

5 血管內皮細胞來源外泌體

據報道，血管內皮細胞(endothelial cell，EC)在骨穩態中具有一定的作用，但EC外泌體在骨質疏松中作用報道較少。查閱相關文獻，僅Song等[57]報道EC來源外泌體抑制破骨細胞的活性，并在OVX小鼠模型中抑制骨質疏松，但EC來源外泌體可被骨髓來源的巨噬細胞(BMM)內化減低作用。通過對EC外泌體miRNA測序，發現外泌體內富含miR-155，遠超于BMM內的miR-155，進而抑制破骨細胞活性。該研究反映了EC外泌體具有抗骨質疏松治療潛力。

6 血清來源外泌體

血清來源外泌體(serum-derived exosomes，SDEs)對評估和診斷OP具有一定的價值。外泌體miRNA與骨質疏松癥的發生發展有著密切的關系。通過對患者血清外泌體miRNA檢測，可以及時預測骨質疏松癥的發生，進而減少脆性骨折的風險，對骨質疏松癥的早期診斷有著重要意義[58-59]。初步研究發現OVX小鼠血清外泌體可以促進成骨細胞增殖和血管內皮細胞生長因子高表達[60]。Huo等[59]開展臨床研究對骨量正常、骨量減少和骨質疏松三類研究對象進行血清外泌體的定量分析，發現17種蛋白在骨量減少和骨質疏松均下調。Xie等[61]對骨質疏松癥或骨質減少的老年患者和正常志愿者血清中的外泌體進行了蛋白質組學定量分析，發現骨質疏松癥患者的SDE中的蛋白質變化不僅抑制成骨細胞的機械感覺和激活，還引發破骨細胞的分化和吸收。相反，骨質減少患者的SDE的主要變化既促進破骨細胞的活化，又促進新骨質的形成，導致骨重塑的代償性升高。正常人SDE可能通過促進骨細胞粘附并抑制衰老相關的氧化應激而對骨骼健康起到保護作用。Ramirez等[62]對20例骨質疏松患者和20例健康婦女的血清外泌體miRNA進行研究，采用實時定量RT-PCR技術對754個miRNAs進行分析，發現miR-140-3p和miR-23b-3p作為絕經后墨西哥混血兒婦女骨質疏松和骨質疏松性骨折的潛在生物標志物。上述研究體現了外泌體及miRNA具有治療骨質疏松的作用，說明人血清外泌體開展臨床研究具有可操作性，對外泌體及miRNA用于臨床治療具有推動作用。

7 牛初乳來源外泌體

牛奶來源的外泌體能在細胞間的通訊中起著重要的作用，可治療肥胖、2型糖尿病、骨質疏松癥、癌癥等疾病[63]。對激素誘導骨質疏松小鼠口服兩個月乳源性外泌體，發現實驗組小鼠的骨礦物質密度顯著提高[64]。牛初乳中分離出的外泌體可能是預防骨質疏松癥，改善骨重塑和抑制骨吸收的潛在候選者，對治療老年性骨質疏松癥提供了重要的策略。

8 外泌體研究展望

原發性骨質疏松是最常見的骨代謝疾病，發病率最高，并發癥最多。通過對不同細胞來源外泌體的相關研究進行簡單綜述，發現細胞外泌體治療POP具有巨大的潛力。特別是間充質干細胞來源外泌體具有重要的促成骨細胞增殖，抑制細胞凋亡的作用，具有研究意義。成骨細胞及破骨細胞來源外泌體能為細胞相互作用構建起橋梁，調節骨代謝，對體外研究具有較大意義。肌細胞外泌體作用的研究，提示肌骨交互可能是治療POP的新靶標。人血清來源外泌體測定對骨質疏松癥的早期診斷及預防具有重要意義，可用于臨床研究，同時對外泌體及miRNA用于臨床治療具有推動作用。與此同時，應重視相關食物來源外泌體的抗骨質疏松作用，例如牛初乳來源的外泌體。

綜上所述，本文主要闡述了不同來源外泌體在防治原發性骨質疏松方面的應用。然而，不同外泌體介導信號通路中具體分子機制未十分明確，同類外泌體存在不同作用miRNA的情況。未來臨床應用也面臨著許多尚未解決的問題。但隨著研究的深入，不同外泌體的作用也將逐漸被發掘，未來的應用前景將十分廣闊。