姜黃與紫色姜提取物光照處理后的抗菌活性研究*

黎曉菊，庹呈杰，周明曦，2，張科濤，張 冰，黃之鐠，張曉梅△，趙 慶△

(1.云南中醫(yī)藥大學(xué)，云南 昆明 650500；2.成都中醫(yī)藥大學(xué)，四川 成都 610072）

姜黃為姜科姜黃屬植物姜黃（Curcuma longa L.）的干燥根莖，是著名中藥，形似姜而色黃故得名。姜黃廣泛種植于云南、廣西、臺(tái)灣、福建等省區(qū)，是多年生草本植物，藥食同源。姜黃味辛，苦，溫，歸脾、肝經(jīng)，有破血行氣、通經(jīng)止痛之功效[1-2]。《本草綱目》記載：“姜黃、郁金、蒁藥三物，形狀功用皆相近，但郁金入心治血，而姜黃兼入脾，兼治氣，蒁藥則入肝，兼治氣中之血，為不同爾”。藥理研究表明，姜黃具有抗氧化、抗炎、治療糖尿病、降血脂、神經(jīng)保護(hù)、抗腫瘤、抗菌等藥效[3-5]。姜黃的主要化學(xué)成分為二苯基庚烷類、萜類，其次還有少量生物堿和甾醇類。其中萜類成分主要為多骨架類型的倍半萜，其次為單萜和二萜[6]。姜黃素類成分屬于二苯基庚烷結(jié)構(gòu)類型，具有廣譜抗癌作用[7]，引起眾多學(xué)者的關(guān)注。姜黃素還可以通過免疫調(diào)節(jié)，預(yù)防新冠病毒（COVID-19）感染[8]。此外，姜黃素作為色素和調(diào)味品廣泛應(yīng)用于食品工業(yè)中，姜黃揮發(fā)油則有抗菌、抗真菌、抗腫瘤等作用[6，9-11]。

紫色姜（Zingiber purpureum Rosc）為姜科姜屬多年生草本植物，分布在云南南部及東南部的熱帶雨林中。紫色姜是云南傣族傳統(tǒng)常用藥，具有健胃消食、散寒和止痛等功效，是傣族成藥雙姜胃痛丸的主藥材之一[12-13]。紫色姜中含有姜黃素類成分，而其揮發(fā)油中含有具抗菌活性的化學(xué)成分[12]。

姜黃素類成分除了具有多種藥理活性外，還具有光敏作用，在光照條件下可激發(fā)氧分子生成單線態(tài)氧，單線態(tài)氧具有很強(qiáng)的氧化性。姜黃素不僅自身具有抗腫瘤活性，還可以在光動(dòng)力學(xué)療法中通過光敏氧化反應(yīng)，殺滅腫瘤細(xì)胞[14-15]。

課題組在研究姜科過氧化物時(shí)偶然發(fā)現(xiàn)，姜黃、紫色姜提取液在光照時(shí)會(huì)產(chǎn)生多個(gè)過氧化物，未經(jīng)光照，則檢測不到過氧化物。由此推測，姜黃素類成分可能催化姜黃、紫色姜的化學(xué)成分發(fā)生光化學(xué)反應(yīng)，而化學(xué)成分的變化，很有可能導(dǎo)致其藥理活性發(fā)生變化。為了驗(yàn)證上述推測，本研究對光照前后的姜黃、紫色姜提取液進(jìn)行了抗菌活性測試。

1 材料與方法

1.1 藥材與試劑 姜黃購買于一心堂藥店，紫色姜購買于西雙版納州傣醫(yī)醫(yī)院。2種藥材均由云南中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院馬偉光教授鑒定。培養(yǎng)基配料等常用試劑均購自雅云生物科技有限公司。有機(jī)溶劑：丙酮、乙酸乙酯、石油醚等均為分析純。

1.2 儀器 打粉機(jī)、研缽、超聲波清洗器（上海科導(dǎo)超聲儀器有限公司）；FA2004電子天平（上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司）；OSB-2100旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海愛朗儀器有限公司）；ES-315高壓蒸汽滅菌鍋（TOMY公司）；恒溫培養(yǎng)箱、電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（上海一恒科學(xué)儀器有限公司）；SW-CJ-2FD潔凈工作臺(tái)（AIRTECH公司）；LED燈（功率100 W，口徑8.5 cm，波長 410～780 nm）。

1.3 指示菌 革蘭氏陽性菌：金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus，ATCC 29213）、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis，ATCC 6633）、肺炎鏈球菌（Streptococcus pneumoniae，ATCC 29212）、恥垢分枝桿菌（Mycobacterium smegmatis，1037），耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（MRSA-1450、1505、2024、1957、28299、1591）。革蘭氏陰性菌：大腸桿菌（Escherichia coli，ATCC 25922）、鮑曼不動(dòng)桿菌（Acinetobacter baumanii，ATCC 19606）、克雷伯氏菌（Klebsiella pneumonia，ATCC 13883）、流感嗜血桿菌（Haemophilus influenzae，ATCC 49247）。真菌：白色念珠球菌（Candida albicans，ATCC 10231），白色念珠球菌耐藥菌（Drug-resistant Candida albicans，23#、1730#、1725#、1732#），以上供試菌株均由課題組前期研究保存。

1.4 培養(yǎng)基 病原細(xì)菌培養(yǎng)基 LB：胰蛋白胨10 g，酵母提取物 5 g，氯化鈉 10 g，瓊脂 15 g，水 1 L，pH 7.2～7.6。真菌培養(yǎng)基、沙保氏培養(yǎng)基：蛋白胨10 g，葡萄糖 40 g，瓊脂 15 g，水 1 L，pH 6.0。

1.5 實(shí)驗(yàn)方法

1.5.1 姜黃、紫色姜的提取與光照處理 分別取粉碎后的姜黃、紫色姜藥材10 g，置于棕色瓶中，加入60 mL丙酮浸泡1 h，超聲提取30 min，過濾。濾渣再加60 mL丙酮，超聲再提取10 min，過濾，合并2次所得濾液。將所得姜黃濾液分為2等份，1份減壓濃縮后避光保存（編號(hào)為CL1）；另外1份置于150 mL無色透明的具塞錐形瓶中，用LED燈照射2 h，減壓濃縮后保存（編號(hào)為CL2）。將所得紫色姜濾液分為2等份，1份減壓濃縮后避光保存（編號(hào)為ZP1）；另外1份置于150 mL無色透明的具塞錐形瓶中，用LED燈照射4 h，減壓濃縮后保存（編號(hào)為ZP2）。

取粉碎后的姜黃藥材1 g，置于50 mL無色透明的具塞錐形瓶，在日光下照射8 h。加入10 mL丙酮浸泡1 h，超聲30 min，過濾、減壓濃縮后保存（編號(hào)為 CL3）。

1.5.2 抗菌活性測試 病原細(xì)菌接種至液體LB培養(yǎng)基，37℃、200 r/min黑暗培養(yǎng) 12 h，白色念珠菌接種至液體沙保氏培養(yǎng)基，28℃、200 r/min黑暗培養(yǎng) 24 h，用液體培養(yǎng)基將各菌液分別稀釋至 1×106～1×107cfu/mL備用。

采用紙片擴(kuò)散法[16]，對未經(jīng)光照與經(jīng)過光照的姜黃提取物（CL1、CL2），紫色姜提取物（ZP1、ZP2）進(jìn)行抗菌活性測試。將稀釋后的指示菌菌液均勻涂布在固體培養(yǎng)基上。分別精密稱取90 mg提取物CL1、CL2、ZP1、ZP2，加入900 μL丙酮溶解提取物至質(zhì)量濃度為100 μg/μL，分別取10 μL上述溶液于5 mm的濾紙片上，濾紙片將溶液完全吸收后，揮干溶劑，貼于接種好指示菌的固體培養(yǎng)基上。每份提取液做3組平行實(shí)驗(yàn)，以10 μL丙酮作為空白對照，以抗生素作為陽性對照（革蘭氏陽性菌以芐基青霉素為陽性對照，革蘭氏陰性菌以卡那霉素為陽性對照，真菌以氟康唑?yàn)殛栃詫φ眨幻總€(gè)濾紙片上的抗生素質(zhì)量為50 μg）。真菌在28℃下培養(yǎng)，其余病原細(xì)菌于 37℃培養(yǎng)，恒溫培養(yǎng)12 h后測量抑菌圈直徑。

1.5.3 薄層色譜法檢測姜黃、紫色姜提取物光照前后的化學(xué)成分變化 采用薄層色譜法檢測姜黃、紫色姜的丙酮提取液光照前后的成分變化，以及姜黃粉末光照 8 h 后的變化。各取 2 mg CL1、CL2、CL3、ZP1、ZP2，溶于0.5 mL丙酮，用毛細(xì)管分別吸取上述溶液各5 μL，在硅膠GF254板上點(diǎn)樣，以石油醚：乙酸乙酯（5∶1）展開，分別以過氧化物顯色劑[17]和三氯化鐵-鐵氰化鉀試劑顯色，拍照記錄薄層色譜圖。

2 結(jié)果

2.1 光照前后的姜黃提取物抗菌活性結(jié)果 采用紙片擴(kuò)散法，對未經(jīng)光照與經(jīng)過光照的姜黃提取物（CL1、CL2）進(jìn)行20種病原菌的抗菌活性測試。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，未經(jīng)光照的樣品CL1，對20種病原菌均未產(chǎn)生抑菌圈；經(jīng)過光照的樣品CL2，對15種病原菌產(chǎn)生抑菌圈，對5種病原菌未產(chǎn)生抑菌圈。其中，CL2對病原菌MRSA-2024、MRSA-1957、MRSA-1591 的抑菌圈都超過了10 mm。由此可見，姜黃樣品經(jīng)過光照后，對大多數(shù)病原菌的抗菌活性有顯著提高，見表1、圖1A、1B。

表1 未光照與光照的姜黃提取物抑菌圈直徑

圖1 光照前后的姜黃、紫色姜提取物對部分菌株的抑菌圈對比

2.2 光照前后的紫色姜提取物抗菌活性結(jié)果 采用紙片擴(kuò)散法，對未經(jīng)光照與經(jīng)過光照的紫色姜提取物（ZP1、ZP2）進(jìn)行20種病原菌的抗菌活性測試。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，未經(jīng)光照的樣品ZP1對6種病原菌有抗菌活性，經(jīng)過光照處理的樣品ZP2對14種病原菌有抗菌活性，其中ZP2對枯草芽孢桿菌、MRSA-1957、MRSA-28299、MRSA-1591的抑菌圈都超過了10 mm，且對恥垢分枝桿菌-1037和白色念珠球菌耐藥菌-1730#的抑菌圈直徑超過了陽性對照。ZP2對11種病原菌的抑制活性都明顯高于未經(jīng)光照的ZP1，僅對MRSA-1450、白色念珠菌耐藥菌1732#的抑制活性低于ZP1。這些結(jié)果說明，紫色姜在經(jīng)過光照后，對大多數(shù)病原菌的抗菌活性有顯著提高，結(jié)果見表2、圖1C、1D。

2.3 薄層色譜檢測姜黃、紫色姜光照前后的化學(xué)成分變化 采用薄層色譜法，以過氧化物顯色劑對姜黃提取物CL1、CL2，紫色姜提取物ZP1、ZP2進(jìn)行檢測。結(jié)果表明，未經(jīng)光照的提取物（CL1、ZP1）中檢測不到過氧化產(chǎn)物，而經(jīng)過光照的提取物（CL2、ZP2）中都檢測到了多個(gè)過氧化物。姜黃粉末光照后再用丙酮提取得到的樣品CL3中也能檢測到過氧化物。這些結(jié)果說明，無論是姜黃、紫色姜的丙酮提取液還是姜黃粉末，其中的姜黃素類成分均能夠催化其它共存的化學(xué)成分發(fā)生光化學(xué)反應(yīng)，產(chǎn)生新的化學(xué)成分。此外，用三氯化鐵-鐵氰化鉀試劑顯色時(shí)，可觀察到CL2產(chǎn)生了至少5個(gè)新生成的還原性成分，見圖2，而ZP2無新還原產(chǎn)物生成。

表2 未光照與光照的紫色姜提取物抑菌圈直徑

3 討論

姜黃、紫色姜提取液在LED光源照射后，抗菌活性發(fā)生了顯著變化，光照之后，試樣對多數(shù)菌株的抗菌活性顯著增強(qiáng)，僅對個(gè)別菌株的抗菌活性降低。由此可見，姜黃與紫色姜化學(xué)成分經(jīng)過光照后，產(chǎn)生了抗菌活性更高的產(chǎn)物。初步推測，在姜黃素類成分的催化下，姜黃與紫色姜的一些化學(xué)成分發(fā)生光化學(xué)反應(yīng)，產(chǎn)生抗菌活性更高的產(chǎn)物。

單線態(tài)氧與天然產(chǎn)物反應(yīng)時(shí)，多數(shù)情況下會(huì)生成過氧化產(chǎn)物或中間體。因此可以采用薄層色譜法檢測光照之后的姜黃或紫色姜提取物是否有過氧化物產(chǎn)生，以此判斷是否發(fā)生光化學(xué)反應(yīng)。考慮到光化學(xué)反應(yīng)的產(chǎn)物可能不僅有過氧化物，因此還采用了三氯化鐵-鐵氰化鉀試劑檢測還原性產(chǎn)物。薄層色譜分析表明，姜黃、紫色姜提取液經(jīng)光照之后，產(chǎn)生了大量的過氧化產(chǎn)物，經(jīng)過光照的姜黃提取液還檢出新生成的還原性物質(zhì)，這表明光照時(shí)發(fā)生了光化學(xué)反應(yīng)。此外，姜黃粉末在光照后也有過氧化物生成。基于上述結(jié)果，推測在光照條件下，姜黃素可催化氧分子轉(zhuǎn)化為單線態(tài)氧。單線態(tài)氧是一種強(qiáng)氧化劑，它與姜黃、紫色姜中的其它共存的化學(xué)成分發(fā)生光化學(xué)反應(yīng)，生成一系列新的化合物。姜黃提取液光照后抗菌活性的提高，可能歸因于一些新生成的化合物。

綜上所述，在姜黃素類成分的催化下，姜黃與紫色姜的一些化學(xué)成分發(fā)生光化學(xué)反應(yīng)，生成了抗菌活性更高的產(chǎn)物。至于光化學(xué)反應(yīng)是如何進(jìn)行的，光化學(xué)反應(yīng)的產(chǎn)物是什么，產(chǎn)率是多少，光照時(shí)間與抗菌活性的關(guān)系如何，這些都還需要在后續(xù)的研究工作中采用其它方法（例如對樣品進(jìn)行指紋圖譜相對定量分析，HPLC-MS分析，等等）進(jìn)行深入探討。此外，姜黃和紫色姜的加工、炮制、儲(chǔ)存過程中，姜黃素類成分能夠催化其它共存化學(xué)成分發(fā)生光化學(xué)反應(yīng)，這有可能會(huì)導(dǎo)致藥物的藥效變化。因此，這兩種藥材在加工、儲(chǔ)存過程中，化學(xué)成分的光化學(xué)反應(yīng)是一個(gè)不可忽視的因素。本實(shí)驗(yàn)僅初步測試了抗菌活性的變化，其它藥理活性的變化，亦值得進(jìn)一步探討。例如姜科萜類成分α-桉醇、coronarin E經(jīng)光化學(xué)反應(yīng)，可得到具有細(xì)胞毒或抗腫瘤活性的產(chǎn)物[18-19]。因此，探討姜黃、紫色姜在光化學(xué)反應(yīng)后抗腫瘤等活性的變化，也有重要意義。本研究工作可為姜科植物的開發(fā)與利用提供科學(xué)依據(jù)和線索。