蒼艾揮發油經豚鼠外耳道給藥的安全性評價*

楊 洪，張建英，任丹妮，王進進，熊 磊，秦 瓊

（1.云南中醫藥大學，云南 昆明 650500；2.云南中醫藥大學第一附屬醫院，云南 昆明 650021）

蒼艾揮發油是以熊磊教授預防上呼吸道感染的臨床驗方為基礎，選用蒼術、艾葉、丁香、藿香、豆蔻、花椒、佩蘭7味中藥組成[1]。組方氣味清香，祛風燥濕止癢，符合“芳香化濁避穢”的用藥原則，部分藥物還有增強機體特異性、非特異性免疫的功能[2-3]。前期急性毒性實驗確定了小鼠灌胃濃度為3.47 mL/kg，相當于兒童最大用量的2 478.57倍，呼吸刺激性實驗證明蒼艾揮發油對家兔呼吸系統無明顯刺激作用[4]。在對肺氣虛大鼠進行灌胃給藥時，發現蒼艾揮發油高、中劑量組CD4+/CD8+比值顯著升高，能夠有效調節T細胞亞群比例，從而改善肺氣虛大鼠肺組織病理變化[5]。蒼艾揮發油經鼻吸收后，能夠快速的分布在肺組織、心臟及腦組織中，展示了經鼻給藥后其良好的肺靶向及腦靶向趨勢[6-7]。

前期研究發現蒼艾揮發油用于空氣消毒、滅菌效果優于醋熏及紫外線消毒，且對白色念珠菌有較強的抑制作用[8]，其組方中單味藥所制的揮發油大都具有抗真菌作用[9-10]。在前期藥效實驗發現蒼艾揮發油對外耳道真菌病常見感染菌如曲霉菌、白色念珠菌、青霉菌均有一定的抑制效果[11]。隨著抗生素、激素的臨床大量應用，外耳道真菌病發病率有上升趨勢。目前外耳道真菌病治療方法存在一定的局限性，臨床效果不盡如人意，且復發率較高[12-15]。蒼艾揮發油對外耳道真菌病常見菌群有一定的抑制作用，為進一步研究其外耳道給藥的可行性，本實驗通過豚鼠外耳道急性毒性、皮膚過敏性、外耳道皮膚刺激性進行考察，為評價該制劑臨床外耳道用藥安全性提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 豚鼠，雌雄各半，體質量219～292 g，由昆明楚商科技有限公司提供，生產許可證號：SCXK（滇）K2018-0001。所有動物均飼養于云南中醫藥大學動物實驗中心，飼養室溫度（23±2）℃，濕度40%～70%，光照周期12 h，自由進食飲水，適應性喂養1周后進行實驗。

1.2 藥物與試劑 蒼艾揮發油取自云南中醫藥大學芳香療法實驗室，蒼艾揮發油的提取[16]采用水蒸氣蒸餾法。按比例稱取蒼術、艾葉等藥物，加8倍量水，浸泡4 h，提取6 h而成。聚山梨酯80（一般藥用，廣州賽國生物科技有限公司產品，批號：EZ4567C109）；用聚山梨酯80作為溶劑，分別將100%蒼艾揮發油原液和聚山梨酯80放入研缽中進行研磨，待溶解后加入適量的純凈水，稀釋成濃度分別為1%、5%、15%濃度的水溶液，每瓶各20 mL，并用等體積聚山梨酯80水溶液作為陰性對照。

1.3 實驗方法

1.3.1 外耳道急性毒性實驗 取健康豚鼠8只，隨機分為外耳道皮膚完整組及外耳道皮膚破損組，每組各4只。實驗前完成稱重、右側外耳道及鼓膜的檢查。外耳道破損組使用消毒后的砂紙卷曲成小火柴棍狀，作“*”樣輕輕搔刮右側外耳道皮膚，以微微出血為原則并且不傷及鼓膜，造成臨床上自然的外耳道損傷，模擬人類自然挖耳導致的外耳道皮膚損傷狀況；另一組右側外耳道皮膚完整無破損。每組豚鼠做好染色標識，前期藥效實驗發現15%為有效濃度，故本實驗選用15%濃度，通過增加給藥次數，使其給藥劑量遠超出臨床劑量，即為急性毒性實驗。將15%蒼艾揮發油水溶液分別滴入豚鼠的右側外耳道內，1次滴入20 μL，上午給藥2次，間隔4～5 h后再給藥2次。給藥次日清水清洗給藥部位，連續處理7 d[17-18]。每天記錄各組豚鼠的體質量，觀察其飲食、皮膚、毛發、睡眠、分泌物、排泄物、外耳道及鼓膜是否有異常變化，并觀察其呼吸系統、中樞神經系統和四肢活動等是否有中毒表現。若出現中毒反應，則記錄反應的癥狀、嚴重程度、起始時間、持續時間、是否可逆等，如出現動物死亡，及時觀察并尸檢，必要時進行病理學檢查。

1.3.2 皮膚過敏性實驗 選擇健康豚鼠16只，按不同濃度的受試藥液隨機分為4組，每組4只。于實驗前做好染色標識并用剪刀剪除背部面積約4 cm×4 cm的長毛，剃須刀剃凈短毛，使皮膚外露，并完成稱重。將豚鼠去毛區域分為大小均等兩格，其中一格為皮膚破損面，用粗磨砂紙對豚鼠背部皮膚進行輕微的摩擦，使皮膚表面微微出血即可；另一格為皮膚完整面，將1%、5%、15%蒼艾揮發油水劑分別滴入對應的豚鼠背部皮膚，對照組選用聚山梨酯80水溶液滴入，每次滴入0.5 mL并用棉簽涂抹均勻，保證給藥面積均為2.5 cm×2.5 cm，且覆蓋皮膚完整面和皮膚破損面，涂抹后用無菌紗布覆蓋給藥區域，并用低過敏膠布固定，放置籠內。6 h后除去膠布和紗布，連續給藥7 d，每天1次，末次給藥24 h后洗去殘留藥物[19]。觀察1、24、48、72 h局部皮膚的紅斑、水腫等情況，按《皮膚過敏反應程度的評分標準》[20]進行評分。

1.3.3 外耳道皮膚刺激性試驗 選擇健康豚鼠16只，按不同濃度的受試藥液隨機分為4組，每組各4只，并做好染色標識，豚鼠右側外耳道為破損模型，同上處理造成外耳道損傷模型，左側外耳道為皮膚完整模型。豚鼠左右耳均放置相同濃度藥液棉球進行對照。將1%、5%、15%的蒼艾揮發油水溶液浸透棉球，第4組用聚山梨酯80水溶液棉球浸濕作為陰性對照，將浸有藥液的棉球放置在豚鼠外耳道內，覆蓋于外耳道內壁，并以干凈的棉球填塞固定，外耳口軟膠布封閉固定，6 h后除去包扎和棉球，每天給藥1次，連續給藥7 d[21]。每天觀察貼藥區外耳道內有無紅斑、水腫、出血、滲液、潰爛、色素沉著、皮膚粗糙或菲薄以及鼓膜顏色，有無穿孔等反應，停藥后繼續觀察72 h，按《皮膚刺激反應評分標準》[22]進行評分。

1.4 統計學分析 采用SPSS 21.0軟件進行統計分析。計量資料以均數±標準差（±s）表示，兩組間比較，方差齊時采用獨立樣本t檢驗，方差不齊時采用非參數檢驗。以P＜0.05表示差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 蒼艾揮發油水溶液對豚鼠外耳道急性毒性作用涂抹藥液期間及給藥后7 d內，所有豚鼠外觀、行為、鼓膜情況、四肢活動、進食、排泄等未見明顯異常，無死亡，體質量增長正常。急性毒性2組均未見明顯毒性，見圖1。完整組體質量與破損組比較，差異無統計學意義（P＞0.05），見表 1。

表1 蒼艾揮發油水溶液對外耳道給藥急性毒性豚鼠體質量增長的影響（（±s，n=4，g）

表1 蒼艾揮發油水溶液對外耳道給藥急性毒性豚鼠體質量增長的影響（（±s，n=4，g）

組別 給藥前 給藥3 d 給藥7 d完整組 274.80±11.68 285.30±5.83 291.45±8.35破損組 275.00±24.80 280.88±25.44 295.40±18.70

圖1 豚鼠急性毒性實驗

2.2 皮膚過敏性實驗 蒼艾揮發油水溶液及聚山梨酯80水溶液，涂抹豚鼠背部，皮膚完整組與皮膚破損組均未出現紅斑、紅腫等反應，過敏反應評分值均為0，致敏率為0%，評價為無致敏性，見表2。

表2 各組豚鼠皮膚過敏性評價及致敏發生率（n=4）

2.3 外耳道皮膚刺激實驗 豚鼠外耳道完整組與破損組連續7 d涂抹蒼艾揮發油水溶液和聚山梨酯80水溶液，均未出現明顯的紅斑、水腫以及鼓膜變化反應。完整組皮膚正常，皮膚破損組7 d后均正常愈合，干痂脫落，無明顯刺激性，見圖2。蒼艾揮發油水溶液、聚山梨酯80水溶液對外耳道及鼓膜刺激反應評分，見表3。

表3 各組豚鼠皮膚刺激反應評分（n=4）

圖2 豚鼠外耳道皮膚刺激性實驗

3 討論

中藥揮發油在耳鼻喉科具有潛在應用前景。有研究報道，辛夷揮發油納米脂質體滴鼻劑用于確診的變應性鼻炎兒童，綜合有效率和主要癥狀有效率，均高于對照組；噴嚏、鼻塞等主要癥狀及血液嗜酸性粒細胞計數均較對照組改善；臨床效果好，療效肯定，副作用少，得到患者的認可[23]。另有研究根據患者癥狀選用不同的天然植物揮發油治療兒童慢性咽炎，療效確切無副作用，易被患兒及家屬接受[24]。本課題通過探究中藥揮發油經外耳道給藥的安全性，使其更好的應用于耳部治療，增強其臨床治療效果，充分發揮中醫藥特色及優勢。

經外耳道給藥是治療耳科疾病的主要給藥方法，其給藥方式一般分為水劑、乳膏劑、噴霧劑給藥[25]。有報道表明水劑滴耳液使用方便，患者依從性較高，藥物分布相對均勻，療效肯定；而膏劑因患者外耳道彎曲或狹窄等因素導致藥物涂抹不到位，容易造成外耳道損傷，患者需經常至門診給藥，依從性較差，從而影響治療效果[26]。目前外耳道真菌病主要治療方法為耳內鏡清理之后運用抗真菌藥物治療，但清理之后的藥物治療選擇及給藥方法未有明確指導[12]。抗真菌水劑在臨床中使用更方便，患者接受程度高，依從性好，藥物分布均勻可觸及深處的病變范圍，但應用于耳部的抗真菌滴耳液暫無上市的外用水劑[27]。因此，研發一種抗真菌能力強的水劑滴耳液具有重要的臨床意義。

蒼艾揮發油是由蒼術、艾葉等組成的經驗方提取而來的復方精油[16]，幾乎不溶于水，通過加入助溶劑，可做成水劑。中藥揮發油不僅具有促透皮吸收作用[28]，且安全性好，對皮膚無刺激和毒性較低[29]，部分中藥揮發油因具有較強的抗菌、抗病毒活性而廣泛用于外科治療[30]。本實驗選用聚山梨酯80作為助溶劑，其在經口途徑、肌肉注射或靜脈注射藥物制劑中大量應用，具有較寬的安全窗[31-32]。在實驗過程中，發現蒼艾揮發油水溶劑安全無毒性能夠很快自然揮發，不會潴留在耳道內，而引起不適。

為了進一步推廣蒼艾揮發油水劑在臨床中的應用，保證其用藥安全性，進行外耳道急性毒性實驗、皮膚過敏性實驗、外耳道皮膚刺激性實驗。結果顯示，蒼艾揮發油水溶劑經外耳道給藥無毒性，對豚鼠一般情況無明顯影響。給藥及恢復期間，所有豚鼠的行為、飲水進食、排泄物、毛發基本正常。蒼艾制劑對豚鼠聽力無影響，對鼓膜、外耳道無刺激性、無過敏性等不良反應，所有豚鼠均無死亡發生，體質量增長正常。以上結果表明蒼艾揮發油是一種安全性較高的外用中成藥，可應用于臨床耳部局部給藥。