八棱海棠耐鹽株組培方法及其后代的耐鹽性研究*

胡愛(ài)雙，吳雅琴，程和禾，張小棟，李凱超，孫 宇，王文成

（1 河北省農(nóng)林科學(xué)院濱海農(nóng)業(yè)研究所，唐山063200）（2 國(guó)家林業(yè)和草原局鹽堿地中心）（3 河北省鹽堿地綠化技術(shù)創(chuàng)新中心）（4 河北省農(nóng)林科學(xué)院昌黎果樹(shù)研究所）

據(jù)估計(jì)，全球約有1/5 的灌溉土地受到鹽漬化影響，這嚴(yán)重影響了當(dāng)?shù)剞r(nóng)林業(yè)生產(chǎn)及生態(tài)環(huán)境建設(shè)[1-3]。種植耐鹽植物改良鹽堿地，成本低，效果好，是開(kāi)發(fā)利用鹽堿地的有效途徑[4]。八棱海棠（MalusrobustaRehd.）屬薔薇科蘋果屬，小喬木，樹(shù)姿優(yōu)美，花量大，觀賞價(jià)值高；根系發(fā)達(dá)，樹(shù)體強(qiáng)健，抗寒、抗旱、耐鹽堿、耐貧瘠等[5]，是蘋果常用的砧木。八棱海棠中有極強(qiáng)的耐鹽株和耐堿株，是優(yōu)異的耐鹽堿種質(zhì)資源[6-9]。八棱海棠為高度雜合種，生產(chǎn)上多采用實(shí)生繁殖，優(yōu)良性狀在子代中不能保持。組織培養(yǎng)是保持八棱海棠優(yōu)良性狀的重要途徑。鄭志新等[10]、李文然等[11]、趙亮明等[12]對(duì)八棱海棠組織培養(yǎng)進(jìn)行過(guò)研究，但未形成完整的體系，關(guān)于耐鹽八棱海棠植株的組織培養(yǎng)也未見(jiàn)報(bào)道。我們以前期篩選得到的耐鹽八棱海棠植株[13]為試材，對(duì)其開(kāi)展組培快繁體系研究，并對(duì)其組培后代的耐鹽性進(jìn)行鑒定，以期為耐鹽八棱海棠在濱海鹽漬地區(qū)的景觀或蘋果產(chǎn)業(yè)中的推廣應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

耐鹽八棱海棠植株由河北省農(nóng)林科學(xué)院濱海農(nóng)業(yè)研究所篩選獲得，并定植于該所現(xiàn)代農(nóng)業(yè)成果轉(zhuǎn)化基地，5 年生；普通八棱海棠植株的組培苗由河北省農(nóng)林科學(xué)院昌黎果樹(shù)研究所提供。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1組織培養(yǎng)

（1）外植體。試驗(yàn)在河北省農(nóng)林科學(xué)院昌黎果樹(shù)研究所生物技術(shù)室進(jìn)行。2018 年3 月中旬從八棱海棠耐鹽植株上剪取無(wú)病蟲(chóng)害、葉芽飽滿的1 年生枝條，帶回實(shí)驗(yàn)室，插入自來(lái)水中，放置于培養(yǎng)室培養(yǎng)。約1 周后葉芽萌動(dòng)，枝條剪成單芽莖段，剝?nèi)[片，露出綠色葉片，用自來(lái)水沖洗干凈，在無(wú)菌條件下，放入100 mL 滅菌的三角瓶中，用70%酒精消毒30 s，無(wú)菌水沖洗3 次，0.1%HgCl2消毒8～10 min，無(wú)菌水沖洗3～5 次，用手術(shù)刀切下休眠芽，接種到誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，置于培養(yǎng)室培養(yǎng)。培養(yǎng)溫度為（25±2）℃，光照16 h/d，光照強(qiáng)度為2 000 lx。

（2）誘導(dǎo)培養(yǎng)基的篩選。MS（30 g/L 白砂糖，6.5 g/L 瓊脂，pH 值5.8）＋0.1 mg/L NAA（萘乙酸），加入不同濃度6-BA（6-卞基腺嘌呤），濃度分別為1.0、1.5、2.0 mg/L。每瓶接種4 個(gè)芽，每個(gè)處理接種30 瓶，30 d 后統(tǒng)計(jì)各處理的芽誘導(dǎo)率。

（3）繼代培養(yǎng)基的篩選。將誘導(dǎo)萌發(fā)的芽接種在繼代培養(yǎng)基上。試驗(yàn)設(shè)4 個(gè)組合，MS（30 g/L白砂糖，6.5 g/L 瓊脂，pH 值5.8）＋0.05 mg/L NAA，加入不同濃度6-BA，濃度分別為0.3、0.5、1.0、1.5 mg/L。每瓶接種4 個(gè)芽，每個(gè)處理接種30 瓶，30 d 后統(tǒng)計(jì)各處理芽的增殖系數(shù)。

（4）生根培養(yǎng)基的篩選。繼代培養(yǎng)30 d 左右，選取長(zhǎng)1.5～2.0 cm 且有3 片以上舒展葉片的健壯苗，從基部切下，轉(zhuǎn)移到生根培養(yǎng)基上誘導(dǎo)生根。生根培養(yǎng)用1/2 MS 培養(yǎng)基（20 g/L 白砂糖，6.5 g/L瓊脂，pH 值5.8），附加0.3 mg/L IAA（吲哚乙酸）＋0.3 mg/L IBA（吲哚丁酸）、0.5 mg/L IAA＋0.5 mg/L IBA 或1.0 mg/L IAA＋0.5 mg/L IBA，每瓶接種5 株苗，每個(gè)處理接種30 瓶，30 d 后統(tǒng)計(jì)各處理生根株率，記錄根系生長(zhǎng)情況。

（5）煉苗與移栽。幼苗長(zhǎng)出不定根3～5 條、長(zhǎng)3 cm 左右，移到日光溫室進(jìn)行煉苗，用遮陽(yáng)網(wǎng)遮陰，1 周后去掉遮陽(yáng)網(wǎng)。煉苗15～20 d 后打開(kāi)瓶蓋，3 d 后移栽。移栽時(shí)用鑷子從瓶中輕輕取出苗，用水洗凈根部瓊脂，栽植在裝有滅菌處理的蛭石、草炭土和細(xì)沙（1∶1∶1）的營(yíng)養(yǎng)缽中，搭塑料小拱棚，溫度保持在25 ℃左右，濕度控制在85%～95%，1 周后逐漸通風(fēng)，2 周后有新根產(chǎn)生，3 周后撤去塑料布。在溫室生長(zhǎng)1 個(gè)月后，營(yíng)養(yǎng)缽中的苗移入田間。

1.2.2組培苗耐鹽性鑒定

在耐鹽株系和普通株系的繼代增殖培養(yǎng)基中附加不同濃度的NaCl，濃度分別為0、0.15%、0.3%、0.45%、0.6%、0.75%，八棱海棠耐鹽株系和普通株系每個(gè)鹽濃度處理接種12 瓶，每瓶接種4 個(gè)芽。14 d 后觀察，根據(jù)葉片受害程度確定鹽害等級(jí)，計(jì)算各處理組培苗的鹽害指數(shù)。

鹽害分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)：0 級(jí)，全株無(wú)鹽害癥狀；1 級(jí)，輕度鹽害，小于20%的葉片邊緣輕微發(fā)黃、枯焦；2 級(jí)，中度鹽害，近50%的葉片發(fā)黃、枯焦或脫落；3 級(jí)，重度鹽害，50%以上的葉片發(fā)黃、枯焦或脫落；4 級(jí)，極重度鹽害，90%以上的葉片枯焦、脫落或植株死亡。

鹽害指數(shù)（%）＝［∑（受害株數(shù)×相應(yīng)級(jí)值）／（調(diào)查總株數(shù)×4）］×100

2 結(jié)果與分析

2.1 組織培養(yǎng)

2.1.16-BA 濃度對(duì)耐鹽株系芽萌發(fā)的影響

在MS＋0.1 mg/L NAA 培養(yǎng)基中，在1.0～2.0 mg/L 范圍內(nèi)，6-BA 濃度越高，芽萌發(fā)率越高，但是6-BA 濃度為2.0 mg/L 的培養(yǎng)基，芽萌發(fā)后需轉(zhuǎn)入低濃度培養(yǎng)基才能正常生長(zhǎng)，否則，葉片皺縮、畸形。誘導(dǎo)芽萌發(fā)的最適宜培養(yǎng)基為MS＋1.5 mg/L 6-BA＋0.1 mg/L NAA。

2.1.26-BA 濃度對(duì)耐鹽株系芽增殖的影響

從表1 可以看出，在MS＋0.05 mg/L NAA 培養(yǎng)基中，6-BA 濃度對(duì)芽增殖和新梢生長(zhǎng)的影響較大。隨著6-BA 濃度的增加，芽的增殖系數(shù)增加。6-BA濃度為0.3 mg/L 時(shí)，幼苗生長(zhǎng)較弱；6-BA 濃度為1.5 mg/L 時(shí)，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，幼苗玻璃化現(xiàn)象嚴(yán)重；6-BA 濃度為1.0 mg/L 時(shí)，1 代苗生長(zhǎng)健壯（圖1），但連續(xù)3 代苗培養(yǎng)基中都附加1.0 mg/L 6-BA，幼苗容易產(chǎn)生玻璃化現(xiàn)象；6-BA 濃度為0.5 mg/L 時(shí)，幼苗生長(zhǎng)健壯。建議試管苗繼代增殖培養(yǎng)基交替使用MS＋0.5 mg/L 6-BA＋0.05 mg/L NAA 和MS＋1.0 mg/L 6-BA＋0.05 mg/L NAA，以保證新梢的正常生長(zhǎng)。

表1 八棱海棠耐鹽株系在不同6-BA 濃度培養(yǎng)基中的增殖培養(yǎng)情況

2.1.3IAA 和IBA 組合對(duì)耐鹽株系生根的影響

從表2 可以看出，以1/2 MS 為基本培養(yǎng)基，IAA和IBA 的濃度配比明顯影響根的質(zhì)量和生長(zhǎng)狀況。當(dāng)配比為1.0 mg/L IAA＋0.5 mg/L IBA 時(shí)，幼苗的生根數(shù)最多，生根株率也高，但根多數(shù)由愈傷組織發(fā)生，移栽時(shí)易碰掉；當(dāng)配比為0.3 mg/L IAA＋0.3 mg/L IBA 時(shí)，根生長(zhǎng)正常，但生根數(shù)較少，生根株率也較低；當(dāng)配比為0.5 mg/L IAA＋0.5 mg/L IBA時(shí)，生根數(shù)較多，生根株率最高，根系正常且健壯（圖2）。

表2 八棱海棠耐鹽株系在不同濃度IAA 和IBA 培養(yǎng)基中的生根培養(yǎng)情況

2.1.4煉苗與移栽

經(jīng)過(guò)在日光溫室進(jìn)行強(qiáng)光和開(kāi)口煉苗后，再移栽至裝有滅菌基質(zhì)的營(yíng)養(yǎng)缽中，罩小拱棚保持溫濕度，耐鹽株系組培苗移栽成活率達(dá)90%（圖3）。

圖1 八棱海棠耐鹽株系組培苗

圖2 八棱海棠耐鹽株系組培苗生根情況

圖3 八棱海棠耐鹽株系苗的生長(zhǎng)情況

2.2 組培苗耐鹽性鑒定

從圖4 和圖5 可知，隨著培養(yǎng)基中鹽濃度的增加，八棱海棠耐鹽株系和普通株系組培苗鹽害指數(shù)均升高，同一NaCl 濃度，普通株系鹽害指數(shù)明顯高于耐鹽株系。NaCl 濃度為0.45%時(shí)，耐鹽株系的鹽害指數(shù)僅為8.33%，鹽害非常輕微，而普通株系鹽害指數(shù)已達(dá)到58.33%，鹽害較重；NaCl 濃度為0.75%時(shí)，耐鹽株系的鹽害指數(shù)雖然達(dá)到41.67%，但組培苗尚都存活，普通株系已出現(xiàn)死亡現(xiàn)象。

圖4 八棱海棠耐鹽株系和普通株系鹽害指數(shù)隨NaCl 濃度上升的變化情況

圖5 八棱海棠耐鹽株系和普通株系在不同NaCl 濃度脅迫下的組培苗生長(zhǎng)情況

3 結(jié)論與討論

本試驗(yàn)的研究結(jié)果顯示，誘導(dǎo)八棱海棠耐鹽株系芽萌發(fā)的最適培養(yǎng)基為MS＋1.5 mg/L 6-BA＋0.1 mg/L NAA，莖尖膨大，葉片正常；建議試管苗繼代增殖培養(yǎng)基為MS＋0.5 mg/L 6-BA＋0.05 mg/L NAA和MS＋1.0 mg/L 6-BA＋0.05 mg/L NAA 交替使用，增殖系數(shù)為2.9～3.8，苗壯、健康；最佳生根培養(yǎng)基則為1/2 MS＋0.5 mg/L IBA＋0.5 mg/L IAA，生根株率可達(dá)95.5%。在溫室進(jìn)行強(qiáng)光和開(kāi)口煉苗后，移栽至裝有滅菌基質(zhì)（蛭石∶草炭土∶細(xì)沙=1∶1∶1）的營(yíng)養(yǎng)缽中，罩小拱棚保持溫濕度，移栽成活率可達(dá)90%。

鹽害指數(shù)是根據(jù)植株生長(zhǎng)表現(xiàn)性狀來(lái)反映植株受鹽害程度的指標(biāo)[14-15]，鹽害指數(shù)越高，說(shuō)明植株受到的鹽害越重。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，普通株系鹽害指數(shù)明顯高于耐鹽株系，說(shuō)明耐鹽株系組培苗有較強(qiáng)的耐鹽性，且其耐鹽性在組培后代中得以遺傳。