鋅對脊髓缺血再灌注損傷保護作用的研究進展

劉智明，尹飛

(吉林大學中日聯誼醫院骨科，吉林 長春 130033)

脊髓缺血再灌注損傷(spinal cord ischemia-reperfusion injury，SCII)是脊髓缺血缺氧的因素消失，重新恢復血供后，其神經功能不僅沒有得到改善，其缺血損傷程度較原水平反而進一步加重，甚至出現脊髓組織神經元不可逆的遲發性死亡的病理狀態[1]。血管外科、胸外科和脊柱外科手術因SCII的發生而復雜化，造成一系列并發癥，如脊髓功能障礙、術后感覺喪失、運動功能損害(如膀胱和腸道)和不可逆的性功能障礙。這些不良事件給患者及其家屬帶來了巨大的心理和經濟負擔[2]。鋅是一種人體所必需的微量礦物質元素，在抵抗SCII的多種代謝和信號通路中起著關鍵作用，在多種新陳代謝和生理功能中也起到了重要作用。此外，鋅還是體內300多種酶和許多其他生物因子(包括激素、細胞因子、肽和生物膜)發揮作用所必需的微量元素。由于鋅廣泛參與蛋白質的組成，對蛋白質發揮其正常功能具有不可或缺的作用，因此鋅對于多種生命活動(例如生長發育，免疫應答，基因表達，傷口愈合)也是必不可少的[3]。本文就鋅對SCII 的幾個保護作用作一綜述。

1 SCII的發病機制

據報道，脊柱外科手術和主動脈介入術后最嚴重的并發癥之一就是SCII，并有可能進一步導致遲發性截癱[4]。SCII的具體發病機制目前尚不清楚，但近年來，對SCII的病因和發病機制的研究主要包括氧自由基介導的脂質過氧化損傷、炎癥反應、細胞內Ca2+超載、以谷氨酸為主的興奮性氨基酸的毒性作用和細胞凋亡等。

1.1 氧自由基介導的脂質過氧化 自由基，化學上也稱為“游離基”，是含有一個不成對電子的原子團，對人體造成傷害的主要是氧自由基。氧化反應是人體進行正常新陳代謝以及給機體供能必不可少的生理過程，但當機體處于病理狀態時，機體的抗氧化體系就很難清除氧化反應產生的過多活性氧(reactive oxygen species，ROS)，而過多的活性氧自由基會進行破壞，引起體內各種生物大分子的氧化應激損傷，包括蛋白質、脂質、DNA 和 RNA等，而脂質過氧化損傷被認為是SCII的主要病理機制之一。這些氧化應激損傷會導致人體正常細胞和組織的損壞，是多種心血管、老年性和免疫性等疾病的重要致病因素。

在病理條件下，ROS產生和消除的抗氧化防御系統破壞，導致ROS的生物利用度增加，出現氧化應激狀態，進而導致脂質過氧化。氧化應激可導致細胞或組織的氧化損傷，這也是DNA損傷的主要原因。由于體內的DNA修復系統無法修復ROS引起的DNA損傷，導致基因組不穩定或突變，從而導致許多慢性退行性疾病的發生[5]。

SCII的發生過程中，過多的活性氧是引起細胞損傷的一個關鍵因素。脊髓在缺血過程中，三磷酸腺苷(adenosine-triphosphate，ATP)分解產生二磷酸腺苷(adenosine-diphosphate，ADP)、 一磷酸腺苷(adenosine-monophosphate，AMP) 和次黃嘌呤，隨后，導致脊髓缺血缺氧的原發病因去除，脊髓組織重新恢復血供，次黃嘌呤代謝產生了大量的氧自由基，這些產生過量的氧自由基可導致脂質過氧化。脊髓組織因為不飽和脂肪酸含量較高，從而對氧自由基導致的脂質過氧化極其敏感，更易受到氧自由基損傷，使膜受體、 膜蛋白酶、離子通道等功能受損，最終導致脊髓組織內的神經細胞不同程度凋亡或壞死。更嚴重的是，這種損傷不會就此停止而是繼續發展，從而造成更嚴重的后果。此外，氧自由基可導致DNA 和 RNA等遺傳物質損傷、刺激眾多炎癥介質產生，進一步引起神經細胞凋亡，最終導致神經細胞功能障礙，發生SCII[6-8]。

1.2 炎癥反應 有研究證實[4]，炎癥細胞因子，包括腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、白細胞介素-1b(interleukin-1b，IL-1b)和白細胞介素-18(interleukin-18，IL-18)，是多種中樞神經系統疾病的主要介質。這些炎癥細胞因子通過繼發性損傷或炎癥反應在SCII中也起了重要作用，很容易導致神經細胞凋亡或死亡。

Zhang等[9]研究發現，SCII發生后，由于氧化應激和血脊髓屏障的破壞，中性粒細胞和神經膠質細胞高度活化和動員，可能通過觸發核因子κB(nuclear factor kappa-B，NF-κB)進一步增加各種促炎細胞因子來啟動炎癥級聯反應。因此，他們通過初步檢測中性粒細胞浸潤的最佳標志物髓過氧化物酶(myeloperoxidase，MPO)活性，發現SCII后MPO、TNF-α和NF-κB水平都有不同程度的升高。這進一步說明炎癥反應參與了SCII的發生與發展。

1.3 細胞內Ca2+超載 SCII發生后，被活性氧損傷的細胞膜通透性增加，從而引起大量 Ca2+內流，使細胞內Ca2+濃度急劇升高。此外，SCII發生后，細胞內 Na+-K+-ATP酶失活，細胞內 Na+濃度升高，K+濃度降低，細胞內高濃度的 Na+能夠促進 Na+與Ca2+的交換，使細胞內的Ca2+濃度進一步升高。Sun等[10]研究發現，大鼠脊髓神經元細胞膜、胞漿以及突起部位均分布有鈣敏感受體(calcium sensing receptor，CaSR)和鈣蛋白酶。SCII后，CaSR 通過釋放細胞內Ca2+庫和促使細胞外Ca2+內流，從而提高細胞內Ca2+濃度。以上因素使細胞內Ca2+達到一定濃度后，就能夠激發鈣蛋白酶活性，從而降解神經元細胞骨架及結構蛋白，引起細胞損傷，最終導致神經功能障礙。

1.4 以谷氨酸為主的興奮性氨基酸的毒性作用 谷氨酸是一種重要的興奮性神經遞質，在神經激活中起主要作用。谷氨酸/胱氨酸轉運體(glutamate/cystine transporter)主要分布于星形細胞和神經元，生理狀態下釋放1分子的谷氨酸，并攝取1分子胱氨酸入胞，兩者相偶聯[11]。有學者報道 SCII 后，缺血缺氧導致細胞 ATP 合成減少，細胞膜表面的Na+-K+-ATP 酶功能受損，導致 Na+大量外流，組織間谷氨酸濃度升高，谷氨酸大量堆積，引起細胞攝取胱氨酸受到抑制，胞內谷胱甘肽合成減少，氧自由基大量堆積，通過刺激神經細胞中活性氧的產生、線粒體超極化和脂質過氧化而導致神經系統損傷[12]。此外，谷氨酰胺誘導的興奮性毒性與許多中樞神經系統疾病的發病有關，包括腦缺血、阿爾茨海默病(Alzheimer's disease，AD)、亨廷頓病(Huntington's disease，HD)、癲癇和肌萎縮側索硬化癥等[13]。

1.5 細胞凋亡 細胞凋亡在SCII 的病理生理中起著重要作用。脊髓缺血再灌注后會產生大量的氧自由基，氧自由基具有極強的氧化活性，能與細胞內的多種生物大分子結合，從而破壞細胞結構與功能，造成細胞凋亡[14-15]。

2 鋅的生理作用

鋅是人體必需的微量礦物質元素之一，也是機體內多種酶、轉錄蛋白及其他蛋白的重要組成部分，在多種代謝和信號傳導途徑中發揮著重要作用[16]。鋅對許多細胞的生理過程至關重要[17]，在基因的穩定和表達，包括染色體構成、DNA 復制、RNA 轉錄等方面都起著重要的作用。除此之外，從傷口愈合到神經和生殖功能，幾乎所有的代謝過程，鋅都發揮著重要作用。鋅是各種生命活動所必需的，它的缺乏會導致生長遲緩、細胞凋亡和神經元變性[18]。

鋅保護生物結構免受自由基的破壞，可能是由于以下幾個因素：含足夠的金屬硫蛋白(metallothioneins，MTS)，是超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)的基本成分，也是硫醇(thiols，RSH)的保護劑，從而阻止化學基團與鐵之間的相互作用[19]。

3 鋅通過抗脂質過氧化減輕SCII

生理劑量的鋅通過抗氧化應激對生物體起到保護作用。大量的臨床和實驗研究表明，人體中鋅的缺乏與氧化應激標志物、DNA損傷和炎性細胞因子水平的升高密切相關，而補充鋅可以逆轉這些不良反應。另有大量研究表明，鋅可以通過抑制脂質過氧化反應來減輕自由基對人體的傷害[16]，作為一種抗氧化劑，主要通過三種機制來發揮作用：(1)保護含有游離巰基的蛋白質；(2)競爭氧化還原活性金屬；(3)誘導特定的抗氧化反應系統[20-21]。

Mazani等[3]的研究表明，補鋅可降低丙二醛(malondialdehyde，MDA)含量，提高抗氧化能力(total antioxidant capacity，TAC)，提高谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase，GSH)和超氧物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)的活性。MDA是血清脂質過氧化產物，而GSH和SOD在機體氧化與抗氧化平衡中起到至關重要的作用。這意味著補充鋅改善了患者的抗氧化狀態，降低了脂質過氧化，提高了SOD的活性，而SOD活性的升高會改善機體抗氧化能力和抗氧化狀態。綜上，鋅可以通過改善抗氧化狀態，降低氧化應激和脂質過氧化來保護SCII。

4 鋅通過抑制細胞凋亡減輕SCII

細胞凋亡是指細胞在發育過程中或在某些因素的作用下，通過細胞內基因及其產物調控而發生的一種程序性細胞死亡，與細胞壞死不同，它是一個主動過程[22]。從宏觀角度來看，細胞凋亡的過程大致可分為以下幾個階段：接受凋亡信號→凋亡調控分子間的相互作用→蛋白水解酶的活化→進入連續反應過程。而從微觀的細胞內部看，細胞凋亡最顯著的特征之一是細胞核的濃縮和分裂成更小的片段[23]。凋亡是SCII后導致神經細胞死亡的主要機制之一，Sun等[24]研究發現，SCII發生后內源性和外源性凋亡途徑中的主要凋亡效應分子半胱氨酸蛋白酶-3(cysteinyl aspartate specific proteinase-3，caspase-3)的表達顯著增加、促凋亡基因Bcl-2相關蛋白X(BCL2-Associated X，Bax)上調，而抗凋亡基因B細胞淋巴瘤/白血病-2基因(B-cell lymphoma-2，Bcl-2)下調。

Kalkan等[25]研究發現鋅通過降低細胞凋亡和保留完整的神經細胞數量來保護SCII。其具體作用機制為：鋅預處理可從分子水平阻止MDA的形成，提高GSH活性，降低黃嘌呤氧化酶活性，從而發揮保護作用。

Lin等[26]使用免疫熒光定位法檢測NeuN陽性細胞中caspase-3的表達，與SCII組相比，補鋅組大鼠脊髓中caspase-3裂解的比例降低。Western印跡分析caspase-3、Bcl-2和Bax的表達水平。與空白對照組相比，鋅治療組小鼠Caspase-3和Bax的表達水平降低，而Bcl-2的表達水平顯著升高。

Li等[27]采用Tunel法和Western blotting法觀察鋅對SCII后細胞凋亡的影響。采用Basso Mouse Scale(BMS)評分和免疫熒光方法觀察神經元凋亡和功能恢復情況。我們發現補鋅顯著增加了粒細胞集落刺激因子(granulocyte colony stimulating factor，G-CSF)的表達。G-CSF是由小膠質細胞/巨噬細胞通過NF-κB信號通路分泌。SCII后G-CSF水平升高，而神經元的凋亡水平卻降低了，從而促進了神經功能的恢復。這表明鋅對SCII的保護作用是通過G-CSF抑制神經元凋亡來實現的。

5 鋅通過抗炎癥反應保護SCII

SCII的主要信號轉導通路之一是Toll樣受體4(Toll-like receptor 4，TLR4)介導的炎癥反應途徑。TLR4通過核因子κB(nuclear factor kappa-B，NF-κB)介導的級聯反應，來促進炎癥細胞因子的基因表達，如白細胞介素1β(interleukin-1β，IL-1β)、白細胞介素6(interleukin-6，IL-6)和腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)，從而導致神經元損傷[6]。Wang等[28]研究發現，大鼠發生SCII 1.5～3.0 h和6～12 h后，TNF-α水平顯著升高，6 h和36 h后，IL-1β水平顯著升高。SCII發生時，氧化應激引起小膠質細胞和星形膠質細胞活化，釋放大量促炎介質，導致脊髓缺血后的血脊髓屏障破壞、脊髓水腫和中性粒細胞內流。此外，Gokce等[29]通過檢測促炎癥細胞因子TNFα和IL-1的水平來評價SCII后的神經炎癥反應，發現與對照組比較，SCII組TNFα和IL-1水平升高。

機體需要通過調節炎癥反應，來應對多種致病因素(如自由基、細胞因子或細菌和病毒抗原)。其中一個主要的炎癥途徑是NF-κB信號途徑。它可以調控細胞凋亡、黏附、增殖、先天性和適應性免疫反應、炎癥過程和細胞應激反應，進而影響TNFα、IL-1β、IL-6和IL-8等促炎因子表達。

A20是一種具有抗炎作用鋅指蛋白，對腫瘤壞死因子受體(tumor necrosis factor receptor，TNFR)和toll樣受體(toll-like receptor，TLR)啟動的NF-κB途徑負性調節。此外，補鋅還可以通過上調A20與DNA特異性結合，降低IL-1β和TNF-α的基因表達，從而抑制NF-κB的激活，下調炎癥細胞因子[30]。此外，缺鋅會增加單核-巨噬細胞細胞系中TNF-α、IL-1β和IL-8的水平，而補充鋅可抑制單核細胞中TNF-α和IL-1β的釋放[31]。

NLRP3炎癥小體(NOD-like receptor P3 inflammasomes)作為先天免疫系統的重要組成部分，主要分布于小膠質細胞，最近的研究也證實其在SCII后明顯表達和激活[26]。其功能是激活caspase-1，進而導致促炎細胞因子IL-1β和IL-18的成熟和分泌，誘導炎癥反應并導致細胞死亡[32，34]。

Lin 等[34]通過ELISA分析顯示，脊髓損傷后第3天，脊髓損傷組NOD樣受體P3(NOD-like receptor P3，NLRP3)水平高于假手術組。WB法檢測NLRP3炎癥相關蛋白NLRP3、IL-1β和Caspase-1的表達。結果顯示，與假手術組小鼠相比，脊髓損傷組小鼠的NLRP3、ASC、IL1和Caspase-1的表達水平升高，而鋅處理組表達水平降低。免疫印跡檢測自噬過程中泛素蛋白表達的變化，結果表明NLRP3可以與泛素結合，說明鋅處理可以招募泛素與NLRP3結合，并通過泛素化修飾導致NLRP3的降解。

Li等[35]發現鋅治療促進了SCII后3、5、7、14、21和28d小鼠運動功能的恢復。此外，鋅還能修復脊髓神經細胞線粒體的結構，促進神經元恢復。同時，鋅還能降低SCII后脊髓組織中活性氧和丙二醛的水平，增加超氧化物歧化酶活性和谷胱甘肽過氧化物酶的生成。鋅發揮作用的具體機制，究其原因是鋅處理可上調核因子紅系相關因子2(NF-E2-related factor，Nrf2)/ 血紅素加氧酶-1(heme oxygenase-1，HO-1)通路水平，下調NLRP3炎癥相關蛋白的表達。

6 鋅轉運蛋白減輕SCII

鋅轉運蛋白(zinc transporter，ZnT)家族至少包含10個成員，ZnT1-ZnT10。它們將鋅從細胞內運輸到細胞外或細胞內的細胞器。在已鑒定的ZnT家族成員中，ZnT1位于細胞膜中，充當細胞內鋅的外排轉運體，對維持細胞鋅穩態和脊髓功能恢復具有重要作用。有數據表明，所有檢測到的ZNTs在脊髓中均有表達，這意味著ZnTs在調節正常和病理條件下脊髓鋅代謝方面具有重要的作用[36]。

ZnT1在中樞神經系統中表達豐富，包括脊髓、大腦皮層、小腦和嗅球。ZnT1是唯一一種主要位于細胞膜上的鋅轉運蛋白，發揮著向細胞外輸出鋅的關鍵作用[37]。鋅的缺乏，可能引起脊髓內環境紊亂，不利于損傷脊髓的恢復，ZnT1通過將胞質內的鋅排出到細胞外，維持神經細胞的鋅穩態，促進神經生長因子的表達，對脊髓功能的恢復具有重要意義。腦源性神經營養因子(brain-derived neurotrophic factor，BDNF)作為一種重要的神經營養因子，在改善神經元病理狀態、促進損傷神經元再生、減少神經元凋亡等方面也發揮著重要作用，ZnT1可以促進內源性BDNF的合成和釋放，減輕脊髓繼發性損傷，促進脊髓功能的恢復[38]。此外，鋅可能參與調節中樞神經系統BDNF及其受體的表達，在SCII的病理生理和治療過程中都發揮重要作用。

7 展 望

SCII造成的脊髓功能障礙、感覺喪失和運動功能損害給患者的家庭和社會帶來了沉重的負擔，因此尋找有效治療SCII的方案變得越來越重要。目前對SCII的治療包括藥物治療，如激素沖擊聯合神經營養藥物、他汀類藥物、米諾環素和中醫中藥治療，還包括缺血預處理和低溫預處理、高壓氧療法等。鋅作為一種人體所必需的微量礦物質元素，通過抗脂質過氧化、抗凋亡和抗炎癥反應對SCII起到一定的保護作用，此外鋅轉運蛋白和鋅指蛋白的作用也不容忽視。綜上所述，鋅有望成為治療SCII的關鍵因素，為治療脊柱外科和體內大動脈介入術并發癥提供新思路。