肺鱗癌組織miRNA-193a 及miRNA-4286 水平與預(yù)后的關(guān)系

畢 銳 王明松 胡 睿 蔣連勇 楊旭輝 鐘 元

上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬新華醫(yī)院心胸外科，上海 200092

肺鱗癌作為肺癌常見(jiàn)病理類型，其化放療敏感性較低[1-3]。然而肺鱗癌術(shù)后患者預(yù)后常常較差，所以高效準(zhǔn)確的評(píng)價(jià)肺鱗癌患者術(shù)后的預(yù)后質(zhì)量對(duì)提高患者術(shù)后的生存率，改善患者生活質(zhì)量具有重要意義[4]。微小RNA（microRNA，miRNA）是一類內(nèi)源性非編碼小分子RNA，廣泛存在于人體中，在基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)中起到重要的調(diào)控作用[5-6]。研究報(bào)道m(xù)iRNA 可長(zhǎng)期穩(wěn)定存在且與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[7-8]，因此miRNA水平的檢測(cè)對(duì)腫瘤的診斷或預(yù)后評(píng)估具有重要意義。本研究分析了肺鱗癌患者的肺癌組織中miRNA-193a 和miRNA-4286 的表達(dá)水平，探討肺癌組織內(nèi)miRNA-193a 和miRNA-4286 水平與肺鱗癌患者預(yù)后的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2016 年5 月—2019 年4 月在上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬新華醫(yī)院（以下簡(jiǎn)稱“我院”）確診且臨床資料完整的126 例肺癌患者為研究對(duì)象，患者術(shù)前均未進(jìn)行放化療治療，肺癌病理類型為鱗癌，經(jīng)病理復(fù)查確認(rèn)。男74 例，女52 例；年齡32～75 歲，中位年齡為58 歲；組織學(xué)分級(jí)：高分化鱗癌41 例，中分化鱗癌56 例，低分化鱗癌29 例；參考2009 年國(guó)際抗癌聯(lián)盟（UICC）TNM 分期標(biāo)準(zhǔn)[8]，入組患者Ⅰ～ⅡA 期49 例，ⅡB～Ⅲ期77 例；淋巴轉(zhuǎn)移情況：74 例伴淋巴轉(zhuǎn)移，52 例無(wú)淋巴轉(zhuǎn)移；患者隨訪時(shí)間為3～60 個(gè)月，平均隨訪時(shí)間為（29.36±10.94）個(gè)月。本研究由我院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有受試者均同意入組并簽署知情同意書(shū)。

1.2 主要試劑與儀器

RNA 提取試劑盒（GeneCopoeia 公司，美國(guó)）；Allin-one miRNA First-stand Kit（GeneCopoeia 公司，美國(guó)）；實(shí)時(shí)熒光定量逆轉(zhuǎn)錄PCR（qRT-PCR）試劑盒（QIAGEN，德國(guó)），實(shí)時(shí)熒光定量PCR 儀（上海楓嶺生物技術(shù)有限公司，中國(guó)）；Nan-oDrop 2000 分光光度計(jì)（賽默飛科技公司，美國(guó)）；miRNA-193a、miRNA-4286、內(nèi)參基因引物（上海生工科技有限公司，中國(guó)）：miRNA-193a，上游引物：5′-GCATAA-CTGGCCTACAAAGT-3′；下游引物：5′-GTGCAGGGTCCGAGG-3′。miRNA-4286，上游引物：5′-TCTCCTGCACCCCACTCC-3′；下游引物：5′-TATGGTTGTTCACGACTCCTTCAC-3′。內(nèi)參U6，上游引物：5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′；下游引物：5′-AAC-GCTTCACGAATTTGCGT-3′。采用20 μL PCR 反應(yīng)體系，即2×定量PCR Mix 10 μL，miRNA 上游引物0.08 μL，miRNA 下游引物0.08 μL，cDNA 模板2 μL，TaqDNA 聚合酶（2.5 U/μL）0.4 μL，ddH2O 補(bǔ)充至20 μL。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

采用miRNA 提取試劑盒提取并純化腫瘤組織及癌旁組織（腫瘤組織∶癌旁組織為1∶1）RNA，使用分光光度計(jì)檢測(cè)RNA 濃度。通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR 系統(tǒng)檢測(cè)miRNA-193a 和miRNA-4286 表達(dá)水平，操作規(guī)程嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)執(zhí)行。40 個(gè)循環(huán)后收集熒光信號(hào)，繪制溶解曲線，計(jì)算miRNA-193a 和miRNA-4286 相對(duì)表達(dá)量，計(jì)算方法為：miRNA 相對(duì)表達(dá)量以ΔCT 表示（ΔCT 為循環(huán)閾值改變量=CT 內(nèi)參-CT目標(biāo)），將腫瘤組織相對(duì)表達(dá)量比值為1 作為分界值[10]，將全部患者分miRNA-193a 高表達(dá)組78 例和低表達(dá)組48 例，miRNA-4286 高表達(dá)組85 例和低表達(dá)組41 例。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 17.0 對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，組間比較采用t檢驗(yàn)，不符合正態(tài)分布的計(jì)量資料采用中位數(shù)表示；計(jì)數(shù)資料采用例數(shù)或百分率表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)。采用Kaplan-Meier 統(tǒng)計(jì)法及Log-rank 法繪制生存曲線并分析組間差異。以P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 肺鱗癌患者腫瘤組織與癌旁組織miRNA-193a和miRNA-4286 表達(dá)比較

肺鱗癌組織中miRNA-193a 相對(duì)表達(dá)量顯著低于癌旁組織，但miRNA-4286 表達(dá)水平高于癌旁組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05）。見(jiàn)表1。

表1 肺鱗癌患者腫瘤組織與癌旁組織miRNA-193a和miRNA-4286相對(duì)表達(dá)量比較（）

表1 肺鱗癌患者腫瘤組織與癌旁組織miRNA-193a和miRNA-4286相對(duì)表達(dá)量比較（）

2.2 肺鱗癌組織中miRNA-193a 和miRNA-4286 水平與臨床病理特征的相關(guān)性

肺鱗癌組織內(nèi)miRNA-193a 和miRNA-4286 水平與年齡、性別、吸煙史和家族史無(wú)關(guān)聯(lián)，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＞0.05），與腫瘤大小、TNM 分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)情況有關(guān)聯(lián)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P ＜0.05）；肺鱗癌組織內(nèi)miRNA-193a 與分化程度無(wú)關(guān)聯(lián)（P ＞0.05），而miRNA-4286 與分化程度有關(guān)聯(lián)（P ＜0.05）。見(jiàn)表2。

2.3 肺鱗癌組織中miRNA-193a 和miRNA-4286 水平與患者預(yù)后的關(guān)系

肺鱗癌組織中miRNA-193a 低表達(dá)組中位生存期為36 個(gè)月（95%CI：0.371～1.198），高表達(dá)組中位生存期為54 個(gè)月（95%CI：0.834～2.696），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.015）；肺鱗癌組織miRNA-4286 低表達(dá)組中位生存期為51 個(gè)月（95%CI：0.962～2.660），高表達(dá)組中位生存期為39 個(gè)月（95%CI：0.376～1.039），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.005）。見(jiàn)圖1。

表2 肺鱗癌組織中miRNA-193a 和miRNA-4286 水平與臨床病理特征的相關(guān)性[例（%）]

3 討論

近年來(lái)越來(lái)越多的研究認(rèn)為miRNA 可作為診斷[11]、評(píng)價(jià)預(yù)后[12]的重要指標(biāo)。miRNA 在肺癌發(fā)生發(fā)展中起著重要的作用，不同miRNA 表達(dá)水平與肺癌的診斷、治療、預(yù)后等具有密切的相關(guān)性[13]。研究表明，miRNA193a 和miRNA-4286 與腫瘤細(xì)胞的增殖、分化、侵襲等多種腫瘤生物行為密切相關(guān)[14-15]。Lin 等[16]研究表明miRNA193a 可抑制結(jié)直腸細(xì)胞的生長(zhǎng)、遷移和血管生成，進(jìn)而發(fā)揮抑癌作用，但也有研究認(rèn)為miRNA193a可促進(jìn)腫瘤發(fā)生發(fā)展[17]；Zhang 等[18]研究發(fā)現(xiàn)miRNA-4286 通過(guò)激活JAK2/STAT3 通路促進(jìn)食管癌的進(jìn)展；另一研究認(rèn)為miRNA-4286 與胃癌具有相關(guān)性[19]。因此這兩種miRNA 對(duì)腫瘤的具體調(diào)控作用仍無(wú)定論，可能與腫瘤類型、miRNA 手性等[20]有關(guān)。

圖1 miRNA-193a 和miRNA-4286 表達(dá)水平與肺鱗癌患者預(yù)后的Kaplan-Meier 生存曲線

本研究選取126 例肺鱗癌患者，首先發(fā)現(xiàn)癌旁組織miRNA-193a 的水平顯著高于肺癌組織，癌旁組織miRNA-4286 的水平顯著低于肺癌組織，提示miRNA-193a 和miRNA-4286 可能與腫瘤的發(fā)生發(fā)展有關(guān)，且兩者對(duì)肺癌的作用可能不同。之后研究?jī)煞NmiRNA與各項(xiàng)臨床指標(biāo)的關(guān)系，miRNA-193a 和miRNA-4286 水平與腫瘤大小、TNM 分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)情況有關(guān)聯(lián)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P ＜0.05）；肺鱗癌組織miRNA-193a 表達(dá)與分化程度無(wú)關(guān)聯(lián)（P ＞0.05），而miRNA-4286 表達(dá)與分化程度有關(guān)聯(lián)（P ＜0.05）。通過(guò)生存預(yù)后分析發(fā)現(xiàn)，miRNA-193a 和miRNA-4286 表達(dá)與肺鱗癌患者預(yù)后密切相關(guān)，表現(xiàn)為miRNA-193a 低表達(dá)組和miRNA-4286 高表達(dá)組預(yù)后不良，提示miRNA-193a 可能具有抑癌作用，而miRNA-4286可能具有促癌作用，兩者均與患者的預(yù)后有關(guān)。霍紅日等[21]研究發(fā)現(xiàn)肺癌患者腫瘤組織miRNA-193a 表達(dá)水平顯著低于健康體檢者，且miRNA-193a 可能是肺癌的診斷指標(biāo)之一；Ling 等[22]研究發(fā)現(xiàn)miRNA-4286 在非小細(xì)胞肺癌中過(guò)度表達(dá)，并負(fù)調(diào)節(jié)PTEN 的表達(dá)，進(jìn)而激活PI3K/AKT 途徑促進(jìn)肺癌細(xì)胞的增殖和遷移，這兩項(xiàng)研究與本研究結(jié)果一致。現(xiàn)如今缺乏miRNA-193a 和miRNA-4286 對(duì)肺癌預(yù)后評(píng)估的研究，但Lin 等[23]研究發(fā)現(xiàn)miRNA-193a 表達(dá)的降低與大腸癌的預(yù)后不良相關(guān)，與本研究趨勢(shì)相似。

綜上所述，本研究探討了miRNA-193a 和miRNA-4286 在肺鱗癌組織中的表達(dá)改變，miRNA-193a 可能具有抑癌作用而miRNA-4286 可能具有促癌作用，兩者均與患者預(yù)后相關(guān)。