肺鱗癌組織miRNA-193a 及miRNA-4286 水平與預后的關系

畢 銳 王明松 胡 睿 蔣連勇 楊旭輝 鐘 元

上海交通大學醫學院附屬新華醫院心胸外科，上海 200092

肺鱗癌作為肺癌常見病理類型，其化放療敏感性較低[1-3]。然而肺鱗癌術后患者預后常常較差，所以高效準確的評價肺鱗癌患者術后的預后質量對提高患者術后的生存率，改善患者生活質量具有重要意義[4]。微小RNA（microRNA，miRNA）是一類內源性非編碼小分子RNA，廣泛存在于人體中，在基因轉錄表達中起到重要的調控作用[5-6]。研究報道miRNA 可長期穩定存在且與腫瘤的發生發展密切相關[7-8]，因此miRNA水平的檢測對腫瘤的診斷或預后評估具有重要意義。本研究分析了肺鱗癌患者的肺癌組織中miRNA-193a 和miRNA-4286 的表達水平，探討肺癌組織內miRNA-193a 和miRNA-4286 水平與肺鱗癌患者預后的關系。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2016 年5 月—2019 年4 月在上海交通大學醫學院附屬新華醫院（以下簡稱“我院”）確診且臨床資料完整的126 例肺癌患者為研究對象，患者術前均未進行放化療治療，肺癌病理類型為鱗癌，經病理復查確認。男74 例，女52 例；年齡32～75 歲，中位年齡為58 歲；組織學分級：高分化鱗癌41 例，中分化鱗癌56 例，低分化鱗癌29 例；參考2009 年國際抗癌聯盟（UICC）TNM 分期標準[8]，入組患者Ⅰ～ⅡA 期49 例，ⅡB～Ⅲ期77 例；淋巴轉移情況：74 例伴淋巴轉移，52 例無淋巴轉移；患者隨訪時間為3～60 個月，平均隨訪時間為（29.36±10.94）個月。本研究由我院醫學倫理委員會批準，所有受試者均同意入組并簽署知情同意書。

1.2 主要試劑與儀器

RNA 提取試劑盒（GeneCopoeia 公司，美國）；Allin-one miRNA First-stand Kit（GeneCopoeia 公司，美國）；實時熒光定量逆轉錄PCR（qRT-PCR）試劑盒（QIAGEN，德國），實時熒光定量PCR 儀（上海楓嶺生物技術有限公司，中國）；Nan-oDrop 2000 分光光度計（賽默飛科技公司，美國）；miRNA-193a、miRNA-4286、內參基因引物（上海生工科技有限公司，中國）：miRNA-193a，上游引物：5′-GCATAA-CTGGCCTACAAAGT-3′；下游引物：5′-GTGCAGGGTCCGAGG-3′。miRNA-4286，上游引物：5′-TCTCCTGCACCCCACTCC-3′；下游引物：5′-TATGGTTGTTCACGACTCCTTCAC-3′。內參U6，上游引物：5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′；下游引物：5′-AAC-GCTTCACGAATTTGCGT-3′。采用20 μL PCR 反應體系，即2×定量PCR Mix 10 μL，miRNA 上游引物0.08 μL，miRNA 下游引物0.08 μL，cDNA 模板2 μL，TaqDNA 聚合酶（2.5 U/μL）0.4 μL，ddH2O 補充至20 μL。

1.3 實驗方法

采用miRNA 提取試劑盒提取并純化腫瘤組織及癌旁組織（腫瘤組織∶癌旁組織為1∶1）RNA，使用分光光度計檢測RNA 濃度。通過實時熒光定量PCR 系統檢測miRNA-193a 和miRNA-4286 表達水平，操作規程嚴格按照試劑盒說明書執行。40 個循環后收集熒光信號，繪制溶解曲線，計算miRNA-193a 和miRNA-4286 相對表達量，計算方法為：miRNA 相對表達量以ΔCT 表示（ΔCT 為循環閾值改變量=CT 內參-CT目標），將腫瘤組織相對表達量比值為1 作為分界值[10]，將全部患者分miRNA-193a 高表達組78 例和低表達組48 例，miRNA-4286 高表達組85 例和低表達組41 例。

1.4 統計學方法

采用SPSS 17.0 對所得數據進行統計學分析，計量資料采用均數±標準差（）表示，組間比較采用t檢驗，不符合正態分布的計量資料采用中位數表示；計數資料采用例數或百分率表示，組間比較采用χ2檢驗。采用Kaplan-Meier 統計法及Log-rank 法繪制生存曲線并分析組間差異。以P ＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 肺鱗癌患者腫瘤組織與癌旁組織miRNA-193a和miRNA-4286 表達比較

肺鱗癌組織中miRNA-193a 相對表達量顯著低于癌旁組織，但miRNA-4286 表達水平高于癌旁組織，差異有統計學意義（P ＜0.05）。見表1。

表1 肺鱗癌患者腫瘤組織與癌旁組織miRNA-193a和miRNA-4286相對表達量比較（）

表1 肺鱗癌患者腫瘤組織與癌旁組織miRNA-193a和miRNA-4286相對表達量比較（）

2.2 肺鱗癌組織中miRNA-193a 和miRNA-4286 水平與臨床病理特征的相關性

肺鱗癌組織內miRNA-193a 和miRNA-4286 水平與年齡、性別、吸煙史和家族史無關聯，差異無統計學意義（P ＞0.05），與腫瘤大小、TNM 分期、淋巴結轉移和復發情況有關聯，差異均有統計學意義（均P ＜0.05）；肺鱗癌組織內miRNA-193a 與分化程度無關聯（P ＞0.05），而miRNA-4286 與分化程度有關聯（P ＜0.05）。見表2。

2.3 肺鱗癌組織中miRNA-193a 和miRNA-4286 水平與患者預后的關系

肺鱗癌組織中miRNA-193a 低表達組中位生存期為36 個月（95%CI：0.371～1.198），高表達組中位生存期為54 個月（95%CI：0.834～2.696），差異有統計學意義（P=0.015）；肺鱗癌組織miRNA-4286 低表達組中位生存期為51 個月（95%CI：0.962～2.660），高表達組中位生存期為39 個月（95%CI：0.376～1.039），差異有統計學意義（P=0.005）。見圖1。

表2 肺鱗癌組織中miRNA-193a 和miRNA-4286 水平與臨床病理特征的相關性[例（%）]

3 討論

近年來越來越多的研究認為miRNA 可作為診斷[11]、評價預后[12]的重要指標。miRNA 在肺癌發生發展中起著重要的作用，不同miRNA 表達水平與肺癌的診斷、治療、預后等具有密切的相關性[13]。研究表明，miRNA193a 和miRNA-4286 與腫瘤細胞的增殖、分化、侵襲等多種腫瘤生物行為密切相關[14-15]。Lin 等[16]研究表明miRNA193a 可抑制結直腸細胞的生長、遷移和血管生成，進而發揮抑癌作用，但也有研究認為miRNA193a可促進腫瘤發生發展[17]；Zhang 等[18]研究發現miRNA-4286 通過激活JAK2/STAT3 通路促進食管癌的進展；另一研究認為miRNA-4286 與胃癌具有相關性[19]。因此這兩種miRNA 對腫瘤的具體調控作用仍無定論，可能與腫瘤類型、miRNA 手性等[20]有關。

圖1 miRNA-193a 和miRNA-4286 表達水平與肺鱗癌患者預后的Kaplan-Meier 生存曲線

本研究選取126 例肺鱗癌患者，首先發現癌旁組織miRNA-193a 的水平顯著高于肺癌組織，癌旁組織miRNA-4286 的水平顯著低于肺癌組織，提示miRNA-193a 和miRNA-4286 可能與腫瘤的發生發展有關，且兩者對肺癌的作用可能不同。之后研究兩種miRNA與各項臨床指標的關系，miRNA-193a 和miRNA-4286 水平與腫瘤大小、TNM 分期、淋巴結轉移和復發情況有關聯，差異均有統計學意義（均P ＜0.05）；肺鱗癌組織miRNA-193a 表達與分化程度無關聯（P ＞0.05），而miRNA-4286 表達與分化程度有關聯（P ＜0.05）。通過生存預后分析發現，miRNA-193a 和miRNA-4286 表達與肺鱗癌患者預后密切相關，表現為miRNA-193a 低表達組和miRNA-4286 高表達組預后不良，提示miRNA-193a 可能具有抑癌作用，而miRNA-4286可能具有促癌作用，兩者均與患者的預后有關。霍紅日等[21]研究發現肺癌患者腫瘤組織miRNA-193a 表達水平顯著低于健康體檢者，且miRNA-193a 可能是肺癌的診斷指標之一；Ling 等[22]研究發現miRNA-4286 在非小細胞肺癌中過度表達，并負調節PTEN 的表達，進而激活PI3K/AKT 途徑促進肺癌細胞的增殖和遷移，這兩項研究與本研究結果一致。現如今缺乏miRNA-193a 和miRNA-4286 對肺癌預后評估的研究，但Lin 等[23]研究發現miRNA-193a 表達的降低與大腸癌的預后不良相關，與本研究趨勢相似。

綜上所述，本研究探討了miRNA-193a 和miRNA-4286 在肺鱗癌組織中的表達改變，miRNA-193a 可能具有抑癌作用而miRNA-4286 可能具有促癌作用，兩者均與患者預后相關。