恙蟲病東方體感染對內(nèi)皮細胞Tie2/Akt/Foxo1通路的影響

衛(wèi) 陽，金迎迎，梁越進，邢 燕,4

恙蟲病東方體(Orientiatsutsugamushi)是引起恙蟲病的病原微生物，是一種脂多糖(Lipopolysaccharide, LPS)缺乏的革蘭氏陰性菌，專性細胞內(nèi)生存并可在感染的內(nèi)皮細胞中自由復制[3]。位于組織和循環(huán)系統(tǒng)之間的內(nèi)皮細胞(Endothelial cell，EC)層是炎癥細胞運轉(zhuǎn)的關(guān)鍵界面，內(nèi)皮細胞間連接和血管泄漏密切相關(guān)。血管滲透性過高是急性炎癥最重要的特征，細胞及體液免疫效應因子可利用血管泄漏進入感染或受損位置，引起宿主器官功能紊亂及休克等不良后果[4-5]。Tie2是一種跨膜內(nèi)皮細胞酪氨酸激酶受體，是細胞間連接的一個重要分子，可調(diào)控血管形成及內(nèi)皮細胞炎癥和通透性。血管生成素(Angiopoietin, Ang)1和2是重要的Tie2的配體[6]。Ang1由內(nèi)皮旁細胞產(chǎn)生，起激動作用，結(jié)合Tie2使其磷酸化，并通過Akt/Foxo1通路以維持血管完整性，抑制血管的泄漏、炎癥因子的表達以及白細胞的招募和轉(zhuǎn)移的作用；Ang2由內(nèi)皮細胞自身產(chǎn)生，與Ang1競爭性地結(jié)合Tie2而對Tie2磷酸化起抑制作用，導致?lián)p傷和血管泄漏[7]。然而，有研究顯示在無菌條件下，Ang2對Tie2信號有激活作用[8]。恙蟲病東方體感染對宿主內(nèi)皮細胞Tie2/Akt/Foxo1信號通路的具體影響尚不清楚。

本研究通過動物及內(nèi)皮細胞感染實驗，檢測Tie2/Akt/Foxo1信號通路關(guān)鍵蛋白的表達和磷酸化水平、炎癥因子和細胞通透相關(guān)蛋白的表達，以分析在恙蟲病東方體感染宿主過程中，Tie2信號的變化及影響，為恙蟲病的防治提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1細菌培養(yǎng)及分離 恙蟲病東方體Karp株(OrientiatsutsugamushiKarpstrain，OtK)在 Vero E6 細胞(猴腎細胞系)中培養(yǎng)增殖。該實驗在UTMB加爾維斯頓國家實驗室的動物生物安全3級實驗室(ABSL3 facility)進行。34 ℃輕搖2 h，再加入含有1% 胎牛血清(FBS)和1% HEPES 緩沖液的DMEM(Gibco)培養(yǎng)基中培養(yǎng)。通常在14～21 d，細胞變圓或有細胞浮起區(qū)域遍布培養(yǎng)瓶時，涂片用Dif-Quik(Fisher Scientific, Kalamazoo, MI)評估感染程度。當有80%-90%的細胞被感染，將這些細菌再次接種到新鮮的單層Vero細胞上。重復6遍后，收集細胞懸液，4 ℃，22 000×g 離心 45 min。將細胞沉淀在蔗糖磷酸-谷氨酸鹽(sucrosephosphate-glutamate，SPG)緩沖液中重懸，再轉(zhuǎn)移至50 mL含有5 mL無菌玻璃珠的錐形管中輕柔蝸旋，使釋放細胞內(nèi)細菌。700×g 離心收集含有細菌的上清液，22 000×g離心45 min，即得到無細胞的細菌沉淀。將細菌在SPG緩沖液中重懸，存于-80 °C。用于感染動物或細胞。

1.2斑點形成實驗(Focus forming assays，F(xiàn)FA) 斑點形成實驗對OtK活細菌數(shù)定量[9]。含1% FBS 和1% HEPES的DMEM培養(yǎng)基在37 ℃ 5% CO2孵箱中培養(yǎng)Vero E6細胞過夜，待細胞長匯合后，將連續(xù)10倍稀釋的OtK菌液(200 μL)種到該細胞單層上。培養(yǎng)2 h后，用熱的含鈣和鎂的Dulbecco’s PBS緩沖液洗培養(yǎng)板以移走細胞外死細菌。再加含1% FBS、0.5% 甲基纖維素和環(huán)十二碳三烯的DMEM細胞培養(yǎng)基到孔板上，在34 ℃培養(yǎng)5 d后，用甲醇4 ℃固定細胞。用含1% BSA的PBS室溫下封閉培養(yǎng)孔30 min。加多克隆兔抗鼠OtK，室溫孵育30 min。再加Alexa-594 山羊抗兔IgG(Invitrogen, Carlsbad CA)孵育30 min。倒置熒光顯微鏡下檢測。取10～100個斑點的OtK感染孔計數(shù)，計算斑點形成單位的濃度定量活菌數(shù)。

1.3動物感染 C57BL/6J野生雌鼠購買自Jackson實驗室，在無特定病原菌條件下飼養(yǎng)。根據(jù)美國德克薩斯大學醫(yī)學分部動物保護和使用委員會批準的實驗方法實驗。所有小鼠感染研究均在UTMB加爾維斯頓國家實驗室的動物生物安全3級實驗室(ABSL3 facility)進行；所有組織處理和分析實驗在生物安全3級或2級實驗室進行。8～12周齡C57BL/6J小鼠經(jīng)尾靜脈注射致死量OtK(4.5×106FFU in 200 mL)，對照小鼠注射PBS。感染后第2、6、10 d，收集組織樣本，立即對細菌失活處理[5]。

1.4細胞培養(yǎng)和感染 人臍靜脈血內(nèi)皮細胞(HUVEC)培養(yǎng)方法同前[10]。HUVECs在含10%熱失活FBS的Pigrow I 培養(yǎng)基、5% CO237 ℃孵箱中傳代。所有實驗用HUVEC都是第5至第7代細胞。細胞維持用含3% FBS的Prigrow I 培養(yǎng)基。HUVEC長匯合時，收集并接種到24孔板培養(yǎng)。HUVEC再次長匯合，添加Ang1(100 ng/mL)或/及OtK(MOI 10)。感染后24、48和72 h后，收集細胞，用于蛋白檢測或RT-PCR檢測。

1.5Western blot 將細胞或組織用含有蛋白抑制劑的裂解液裂解，電泳分離后將樣本轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，封閉后加兔抗鼠一抗：Ang2抗體(catalog #ab8452)或Tie2(ab137786)、p-Tie2(AF2720)、Akt(9272)、p-Akt(5012)、Foxo1(2880)、p-Foxo1(9461)、GATA2(ab109241)、VEGFR2(ab39256)、VE-Cadherin(ab33168)、HMGB1(ab227168)、β-actin(NB600-532)4°C過夜后，加熒光素標記的山羊抗兔IgG[Goat Anti-Rabbit IgG H&L(HRP)，#4050-O5]室溫作用1 h，再用ECL(Thermo Scientific, Waltham, MA, USA)顯色，ImageJ軟件定量并用β-actin的結(jié)果作歸一化處理。

1.6qRT-PCR 從肺臟組織和細胞樣本中提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄后進行實時定量PCR分析。對照為肺臟正常組織或僅加培養(yǎng)基的細胞。β-actin的引物為5′-CGAGGCCCAGAGCAAGAGAG-3′和 5′-CGGTTGGCCTTAGGGTTCAG-3′，TNF-α為 5′-TGAGCACAGAAAGCATGATCC-3′和 5′-GCC-ATTTGGGAACTTCTCATC-3′，IFN-γ為 5′-AC-TGGCAAAAGGATGGTGAC-3′和 5′-TGAG-CTCATTGAATGCTTGG-3′，IL-6為 5′-GTTCTCTGGGAAATCGTGGA-3′和 5′-GAAATTGGGGT-AGGAAGGA-3′。

2 結(jié) 果

2.1OtK感染小鼠肺臟導致Tie2信號紊亂及炎癥因子表達 經(jīng)尾靜脈注射小鼠致死劑量細菌或PBS，在感染后第2、6、10 d 收集肺臟組織，Western blot檢測發(fā)現(xiàn)，第6、10 d Tie2表達明顯下降；p-Tie2水平也呈相同趨勢(圖1A和圖1B)。Ang2表達升高，并于第2 d 達到峰值(圖1C)。炎癥因子HMGB1[11]隨著小鼠肺臟感染而表達增加(圖1D)。IFN-γ、TNF-α和IL-6的mRNA水平在第6、10 d 表達明顯增加(圖1E)。提示，OtK感染誘導小鼠肺臟Ang2產(chǎn)生并抑制Tie2信號激活，同時加重炎癥反應。

Mice were infected with OtK or PBS(ctrl)for lung tissues collection at indicated days of infection(D2, D6, D10).(A)Lung tissue homogenates(20 μg/lane)were measured by Western blots for the levels of total Tie2 proteins,(B)phospho-Tie2(p-Tie2),(C)Ang2,(D)HMGB1, and compared with the β-actin controls.(E)TNF-α, IFN-γ and IL-6 mRNA levels in mouse lungs were measured via qRT-PCR; data are presented as relative mRNA values normalized to β-actin.Statistically significant values are referred to as *: P<0.05; **: P<0.01; ***: P<0.001, respectively.(compared with lungs without infection).

2.2OtK感染內(nèi)皮細胞導致Tie2/Akt/Foxol信號紊亂 Otk感染 HUVEC 細胞后(圖2)，Tie2表達增加，但p-Tie2水平持續(xù)降低。感染48 h，Tie2下游Akt表達升高，但p-Akt水平持續(xù)降低；感染48 h，F(xiàn)oxo1的磷酸化(p-Foxo1)水平?jīng)]有顯著變化，但Foxo1水平增加，提示Foxo1的去磷酸化增強，細胞核內(nèi)積累增多，導致Foxo1靶基因的轉(zhuǎn)錄增加。Foxo1位于Akt下游，是一種轉(zhuǎn)錄因子，調(diào)控多種生理病理功能[12-13]。HMGB1是Foxo1的靶基因之一，其表達呈持續(xù)增加(圖2)。提示，OtK感染HUVEC細胞導致Tie2信號活性減弱和炎癥因子表達增強，其結(jié)果支持小鼠肺臟感染結(jié)果。

(A)HUVEC were measured by Western blots for the levels of total Tie2 proteins, phospho-Tie2(p-Tie2), Akt, p-Akt, Foxo1, p-Foxo1 and HMGB1, and compared with the β-actin controls;(B)relative protein expression normalized to β-actin Statistically significant values are referred to as *: P<0.05; **: P<0.01; ***: P<0.001, respectively.(compared with cells cultured just by medium at same culture time).(the arrow points the location of p-Foxo1).HUVEC were inoculated with MOI 10 OtK or PBS.

2.3Ang1可部分改善OtK感染內(nèi)皮細胞中Tie2信號的變化 Tie2的另一配體Ang1是由內(nèi)皮旁細胞表達而不在內(nèi)皮細胞中表達，因此在HUVEC培養(yǎng)過程加入重組人源Ang1或/并OtK，檢測此時Tie2信號變化。如圖3所示，感染48 h，Ang2表達明顯升高，Tie2和p-Tie2水平?jīng)]有顯著變化；感染72 h，Ang2表達進一步增加，而Tie2和p-Tie2表達顯著降低。與不加Ang1的48 h 結(jié)果相比較(圖2)，Ang1可部分改善或者推遲細菌對Tie2信號的抑制作用。

HUVECs were cultured to confluence, and then added Ang1(100 ng/ml)with or without Otk(MOI 10).Cells were collected at(A)48 and(B)72 hours and measured via Western blot.Shown are data from independent Experiment.Values for each protein were normalized to β-actin.n=3; *: P<0.05; **: P<0.01; ***: P<0.001; ns, no significance(compared with Cells cultured just by medium).

2.4OtK感染內(nèi)皮細胞對通透性蛋白的影響 培養(yǎng)HUVEC細胞長至匯合后，加入Ang1(100 ng/mL)或/并 OtK(MOI 10)，48 h后收集細胞做WB檢測。結(jié)果如圖4所示，OtK感染顯著降低了血管內(nèi)皮生長因子受體2(VEGFR2)、血管內(nèi)皮鈣粘蛋白(VE-Cad)和GATA結(jié)合蛋白2(GATA2)的表達。提示，OtK感染削弱內(nèi)皮細胞的穩(wěn)定性。

(A)Cells were collected at 48 hours and measured via Western blot.Shown are data from independent Experiment.(B)Values for each protein were normalized to β-actin.n=3; *:P<0.05; **: P<0.01(compared with Cells cultured by Ang1 only).

3 討 論

盡管恙蟲病是一種重要的傳染性疾病，可能部分由于細菌培養(yǎng)、基因修飾或宿主-細菌間相互作用的可視化研究困難等因素，使其病理研究相對缺乏。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，在嚴重恙蟲病東方體感染肺臟組織中，受體Tie2的轉(zhuǎn)錄和功能都顯著降低，提示Tie2/Ang媒介的內(nèi)皮細胞紊亂在嚴重恙蟲病中起重要作用[14]，但其分子機制仍需深入研究。本文在此基礎上進一步探索了Orientiatsutsugamushi感染對Tie2信號及其下游通路的影響。

Tie2在血管重構(gòu)和上皮細胞穩(wěn)定方面起著至關(guān)重要的作用，導致胚胎致死性而無法得到Tie2敲除鼠。課題組對模型小鼠肺臟和內(nèi)皮細胞的Tie2信號活性進行檢測，發(fā)現(xiàn)Tie2和功能性p-Tie2的水平隨著感染發(fā)展而持續(xù)降低；盡管不清楚是何種因子或網(wǎng)絡調(diào)控內(nèi)皮細胞Tie2的活性，但可檢測激活內(nèi)皮細胞的促炎因子IFN-γ、TNF-α和IL-6表達顯著升高(圖1)。

Tie2及其下游Akt/Foxo1信號對血管成熟和穩(wěn)定非常關(guān)鍵，而蛋白磷酸化水平代表其活化程度。Orientiatsutsugamushi感染導致Tie2和Akt磷酸化程度降低，而Foxo1去磷酸化提高(圖2)。提示，Orientiatsutsugamushi對Tie2/Akt/Foxo1信號起抑制作用。

Ang2是Tie2的一個重要配體。Ang2既有組成型表達，也有誘導型表達，因為不論體內(nèi)體外實驗，感染或未感染樣本，Ang2都有表達。隨著感染進程的發(fā)展，Ang2表達增加，而Tie2和p-Tie2卻不斷降低，提示Orientiatsutsugamushi感染使Ang2對Tie2有抑制作用，而在未感染時Ang2可能有保持Tie2信號活性的作用(圖1和圖3)。Tie2的另一個配體Ang1，可部分恢復或者推遲感染對Tie2信號的抑制。

除Tie2信號外，血管內(nèi)皮生長因子受體(VEGFR2)，血管內(nèi)皮細胞鈣粘素(VE-Cad)和GATA結(jié)合蛋白2(GATA2)在血管維持與更新中均起重要作用，影響細胞通透性。而Orientiatsutsugamushi的感染導致這幾種蛋白表達降低(圖4)，提示感染可抑制多種內(nèi)皮細胞間穩(wěn)定關(guān)系，從而增加其通透性。

本研究從一種新視角探索嚴重恙蟲病的致病機制，通過分析Orientiatsutsugamushi對小鼠肺臟及內(nèi)皮細胞的影響，發(fā)現(xiàn)Tie2/Akt/Foxo1信號的失活可能是內(nèi)皮細胞失穩(wěn)的重要因素，提示Tie2信號可能是保護嚴重恙蟲病患者血管免受損傷的潛在治療靶點之一。

利益沖突：無