食管鱗癌患者血漿miR-106b-3p 和miR-214 檢測的臨床價值

王中平，范曉英，李亮亮，武京學，張文娟，董魁，馬立東，喬冠恩(通信作者)

（1.邯鄲市第一醫院，河北 邯鄲056002；2.邯鄲市中心醫院感染科，河北 邯鄲056000；3.成安縣中醫院 內科，河北

邯鄲056700 ；4.館陶縣人民醫院 消化科，河北 邯鄲 057750）

0 引言

食管癌（esophageal carcinoma，EC）是常見的消化道惡性腫瘤，具有極高的患病率和致死率，在所有癌癥的患病率及致死率排名中，EC 分別為第8 位和第6 位[1]。根據病理學分類，食管鱗狀細胞癌（esophageal squamous cell carcinoma，ESCC）是最常見的EC 病理類型[2]，我國約90%左右EC 患者的病理學分型是ESCC。目前，我國ESCC 存在臨床治療效果不佳、預后較差的特點[3]，但到目前為止，ESCC 確切的病因及分子調節機制尚未完全闡明，因此，闡明ESCC 的發病機制非常重要。微小RNA（miRNAs）既可作為致癌分子也可作為抑癌分子，通過調控其靶基因的表達水平而對癌細胞的增殖、凋亡和轉移等產生影響[4]。miR-106b-3p 和miR-214 在ESCC 中的具體功能，目前鮮有報道。本研究采用反轉錄定量聚合酶鏈反應（RT-qPCR）技術檢測ESCC 患者和健康者的血漿中miR-106b-3p 和miR-214 表達水平，并結合臨床病理資料，探討它們與ESCC 的關系。

1 材料和方法

1.1 研究對象

1.1.1 ESCC 患者

取2016 年06 月至2017 年08 月邯鄲市第一醫院及蘇州大學附屬第一醫院確診的ESCC 患者的外周血，共40 例。其中男性23 例，女性17 例，年齡38～77 歲，平均（60.9±11.6）歲。所有患者均無其他腫瘤病史，釆取外周血標本前及手術前均未行放療、化療、生物治療等干預措施。

1.1.2 健康體檢者

收集30 例同期健康志愿者的外周血，均無腫瘤、高血壓、糖尿病、心臟病等病史。與ESCC 患者在性別、年齡等情況無統計學差異(P＞0.05)，具有可比性。

1.2 主要試劑

Trizol 試劑及逆轉錄試劑盒購于美國Invitrogen 公司，PCR 試劑盒購于徳國Roche 公司，引物由南京金斯瑞公司合成。

1.3 方法

1.3.1 標本釆集與處理

采集ESCC 患者和健康體檢者空腹靜脈血4mL,迅速注入EDTA 采血管中，輕輕混勻，4℃ 3500×g 離心10min，取上淸液放入新的無RNA 酶EP 管中，放置-80℃冰箱中待用。

1.3.2 血漿中總RNA 的提取

取EP 管中的血漿標本250ul，加入750ul Trizol 裂解液，混勻后依次加入三氯甲烷、異丙醇等試劑，按說明書提取總RNA。總RNA 經NanoDrop ND-2000 分光光度計測定濃度

及純度，并電泳檢測RNA 完整性，質量合格后用DEPC 水溶解保存在-80℃，用于后續實驗。

1.3.3 反轉錄反應

取2ulRNA 入EP 管中，用DEPC 水加至11ul，65 ℃放置5 min 后冰浴5 min 離心，加入5×Reaction buffer 4.0ul、dNTPs 2.0ul、Rnase Inhibitor1.0ul、RT 酶 1.0ul，離心后42℃孵育60min，70 ℃反應10 min 后立即取出冰浴冷卻，合成cDNA，于-20℃保存。

1.3.4 實時熒光定量PCR 反應

合成cDNA 后，以Roche 公司的Fast Start Universal SYBR Green Master（Rox）熒光定量PCR 試劑盒來擴增目的基因，U6 為內參基因，血漿miRNA 含量釆用相對表達量2-ΔΔct 表示。

1.4 統計學處理

采用GraphPad5.0 軟件分析數據。多組間數據比較采用方差分析,兩組間數據比較采用t檢驗，采用ROC 曲線分析miR-1O6b-3p 及miR-214 對ESCC 診斷價值，P＜0.05 表示有統計學差異。

2 結果

2.1 食管鱗癌患者和健康體檢者的血漿miR-106b-3p、miR-214 表達情況

在食管鱗癌患者術前的血漿中miR-106b-3p 及miR-214 表達量分別為（0.684±0.13）及（0.832±0.14），健康體檢者的血漿中 miR-l06b-3p、miR-214 表達量分別為（0.21±0.03）及（0.28±0.05）,兩者與健康組相比存在顯著差異，具有統計學意義。

2.2 miR-106b-3p 及miR-214 的表達與臨床病理特征之間的關系

通過對臨床及病理資料的分析，發現食管鱗癌患者血漿miR-IO6b-3p 及miR-214 隨著患者TNM 分期増加及淋巴結轉移而明顯上調，差異有統計學意義（P＜0.05）,而與患者年齡、性別無關(P＞0.05)。

2.3 血漿miR-1O6b-3p 和miR-214 診斷食管鱗癌的價值

經過ROC 曲線分析顯示，術前血漿miR-1O6b-3p 相對表達量診斷食管鱗癌的最佳臨界值為≤0.169，AUC 為0.833,敏感性為74.5%，特異性為82.6%。術前血漿miR-214 相對表達量診斷食管鱗癌的最佳臨界值為≤0.169，AUC 為0.834,敏感性為76.2%，特異性為84.3%。

3 討論

miRNAs 是調節人類表觀遺傳的重要分子之一，是一類長度大小約為20-22 個核苷酸左右的非編碼小RNA，參與了人體幾乎所有的生物學調節途徑[5,6]。miRNAs 能夠通過其堿基序列區域與其相應靶目標mRNA 的3'-非翻譯區（3'-untranslated region，3'-UTR）中的互補堿基序列進行完全或不完全的互補結合，在基因的轉錄后階段調控其相應靶目標mRNA 的表達水平。在癌癥中，miRNAs 既可作為致癌分子也可作為抑癌分子，通過調控其靶基因的表達水平從而對癌癥細胞的增殖、凋亡和轉移等產生影響。在人類miRNAs 中，約50%左右的miRNAs 所在的基因組區域與癌癥之間存在密切的聯系[7]。因此，癌組織中異常表達的miRNAs 對腫瘤的早期診斷、組織類型的分類及轉移及預后等方面有著極其重要的價值[8]。

miR-106b 是miR-106b-25 家族中的一員，在多種腫瘤中異常高表達，具有調控腫瘤細胞遷移、侵襲、增殖等重要的功能。李元梅等研究顯示，miR-106b 在甲狀腺癌組織中的表達水平顯著低于相應癌旁組織，提示其在甲狀腺癌的發生發展中發揮抑癌基因作用[9]；施莉等采用miRNA 表達芯片檢測了3 例胃癌患者組織標本，結果示miR-106b 在發生淋巴結轉移患者的胃癌組織最高[10]；韓東等研究顯示食管鱗癌組織miR-106b 相對表達量高于癌旁正常組織[11]。然而迄今為止，關于miR-lO6b-3p 在ESCC 患者血漿中表達的研究尚未有報道。本實驗結果顯示ESCC 患者的血漿miR-106b-3p 表達水平明顯高于健康者 (P＜0.01 )，且隨著患者TNM 分期増加及淋巴結轉移而明顯上調，其診斷ESCC 的敏感性為74.5%，特異性為82.6%，和既往報道miR-1O6b 的情況相似[12]，說明miR-1O6b-3p 可作為一個新的腫瘤生物學標志，在臨床上可通過檢測血漿miR-l06b-3p 來協助ESCC 的診斷及預后判斷。

miR-214 在不同腫瘤中的表達水平不同，可作為癌基因或抑癌基因在腫瘤發生、發展、侵襲等過程中發揮作用[13]。目前，血液miR-214 已被證實可作為乳腺癌、膀胱癌等多種癌癥的特異性標志物而在臨床中應用[14]。Li 等[15]應用RTqPCR 檢測98 例原發性肝癌患者和3 株肝癌細胞中miR-214-3p 的表達，結果表明，與正常肝組織相比，肝癌組織及復發肝癌組織中miR-214-3p 的表達下調，Yang 等[16]研究顯示，miR-214 在胃癌組織及細胞中均升高。關于miR-214 在ESCC 中的表達，Wang 等[17]的研究顯示其在ESCC 組織及細胞中的表達下降，認為miR-214 在ESCC 中為抑癌基因，而Q1AO 等[18]研究發現是致癌基因。關于ESCC 患者血漿miR-214 的表達情況，目前尚未見報道。本研究通過逆轉錄定量PCR 方法檢測ESCC 患者及健康人群血漿miR-214 表達水平，發現ESCC 患者血漿miR-214 表達水平明顯高于健康者(P＜0.01), miR-214 表達水平與ESCC 分期及淋巴結轉移情況有關，ROC 曲線分析顯示其可作為區分ESCC 與健康者的分子標志物，因此，臨床上miR-214 可作為新的輔助診斷ESCC 的血液腫瘤標志物。

總之，上調的ESCC 血漿miR-1O6b-3p、miR-214 表達水平反映了ESCC 的進展情況，可作為新的腫瘤分子標志物及預后判斷指標，對指導臨床診治具有一定的價值。