膽管癌免疫治療的研究進展

曹秀洋，王利民

(1.華北理工大學 研究生學院，河北 唐山 063000；2.唐山中心醫院 肝膽外科，河北 唐山 063000）

0 引言

膽管癌最早于1840 年由Durand-Fardel 首次提出[1]，是一組起源于膽管上皮細胞的惡性腫瘤，根據其解剖部位不同可分為肝內膽管癌（intrahepatic cholangiocarcinoma,ICC）、肝門部膽管癌（perhilar/hilar cholangiocarcinoma,PCC）和肝外膽管癌（extrahepatic cholangiocarcinoma,ECC）。膽管癌發病率較低，然而在過去的15 年里，膽管癌的發病率在世界范圍內卻呈上升趨勢[2]。外科治療僅限于少數處于疾病早期的患者，絕大多數膽管癌患者就診時已處于疾病中晚期，失去了手術治療的機會，其中位生存期為3-6 個月，5 年生存率僅為5%-10%[3,4]。目前膽管癌的一線標準化療方案有包括以吉西他濱聯合順鉑的GC 方案，吉西他濱聯合替吉奧的GS 方案以及吉西他濱、替吉奧聯合順鉑的GCS 方案[5]。盡管如此，晚期膽管癌的中位總生存期也只有不到一年的輕微改善[6]。由于膽管癌的治療方案有限，且總體預后不佳，因此尋找膽管癌最有效的治療方法已成為目前臨床醫生迫切需要解決的一項難題。近年來，腫瘤的免疫療法在治療惡性黑色素瘤和非小細胞肺癌方面取得了巨大的成功，極大地改變了這些疾病的自然史。雖然膽管癌的許多危險因素與慢性炎癥性疾病有關，但免疫系統在膽管癌的病因中也起著至關重要的作用，有研究表明，在包括通過肽或樹突狀疫苗增強免疫系統、過繼性T細胞治療以及使用免疫檢測點抑制劑等途徑在治療膽管癌方面取得了一定的療效。現將近幾年國內外在膽管癌免疫治療方面的相關研究進展作一綜述。

1 腫瘤的宿主免疫反應

正常人體免疫系統的功能是保護宿主細胞免受外來病原體的侵害，同時保持對自身的免疫耐受性。固有免疫應答是我們人體免疫系統的第一道防線，當有外來病原體侵入機體時，自然殺傷（NK）細胞、粒細胞和吞噬細胞能在幾分鐘到幾小時內迅速做出防御反應，然后模式識別受體（pattern recognition receptor, PRR）識別結合病原體及其產物或體內凋亡、畸變等細胞表面的相關配體，體液系統中的補體、細胞因子等也做出快速的防御反應，介導產生非特異性抗腫瘤及參與適應性免疫應答的啟動和效應的全過程。與之相反，適應性免疫應答具有抗原特異性，它是通過招募T 細胞來有針對性的消滅外來病原體的。樹突狀細胞（dendriticcell，DC）是一種專職性抗原提呈細胞（antigen-presenting cell,APC），可組成性表達MHC Ⅱ類分子、共刺激分子和黏附分子，具有直接攝取、加工和提呈抗原的功能，也是連接固有免疫應答和適應性免疫應答的“橋梁”，因為樹突狀細胞可以識別早期的炎癥信號，并可以通過處理外來抗原為后期的T 細胞成熟做準備。抗原特異性效應T 細胞可以對靶向病原體產生細胞毒性和隨后的記憶效應。

在惡性腫瘤這一背景下，免疫系統通常能識別由基因異常所引發的外來抗原,并在腫瘤發生早期消滅腫瘤[7]。然而，某些癌癥還可以通過限制宿主自身免疫防御受體的表達、招募免疫抑制細胞、分泌免疫抑制的細胞因子或限制其他宿主免疫系統有效性的選擇性免疫編輯從而避免免疫系統遭到破壞，也同樣具有相當重要的臨床意義[7-9]。考慮到這種相互作用，免疫細胞在不同惡性腫瘤中的浸潤有顯著的易變性。一般來說，在惡性腫瘤中，腫瘤浸潤淋巴細胞（tumor infiltrating lymphocytes ，TIL）的增加與腫瘤的良好預后有關。相應的，在膽管癌中有研究表明30%-50%的膽管癌腫瘤組織標本中CD8+、CD4+T 細胞和樹突狀細胞浸潤率的增加與患者總生存率的提高或腫瘤發生轉移的概率降低有關[10,11]。這是將免疫療法結合到膽管癌中以增強宿主免疫應答來殺傷膽管癌腫瘤細胞的基本原理。

2 腫瘤疫苗

腫瘤疫苗可通過激活自身免疫系統產生適應性免疫應答從而識別和清除腫瘤細胞。宿主免疫系統可通過全細胞疫苗、抗原特異性肽疫苗或負載有抗原的樹突狀細胞來增強對腫瘤特異性抗原的敏感性。對于膽管癌而言，有兩種相關抗原可用于膽管癌的疫苗治療，他們是Wilms 腫瘤蛋白1（Wilms'tumer protein,WT1）和黏蛋白1（Mucin1,MUC1）[12], 在多種惡性腫瘤中均可檢測到WT1 和MUC1 基因突變與患者的預后不良和藥物耐藥性有關[13,14]。雖然膽管癌中這些基因突變的意義尚不確定，但是在80%的膽管癌中我們發現了WT1基因突變[13]，90%的膽管癌也被報道過曾過度表達MUC1 基因，并認為MUC1 基因的過表達與膽管癌患者總生存期降低有關[15]。

在一項WT1 疫苗聯合吉西他濱治療晚期膽管癌的研究中顯示[16]，8 例膽管癌患者在整個研究過程中表現出良好的耐受性和安全性，50%的患者在2 個月時病情穩定，中位生存期為288 天。接種疫苗后65%的患者可檢測到WT1 特異性T 細胞，但未發現WT1 特異性T 細胞與陽性結果存在相關性[16]。8 例晚期胰腺癌和膽管癌患者接種MUCI 肽疫苗的一期臨床實驗中同樣表現出了良好的耐受性，但有7 例患者出現了疾病進展。通過增加抗MUC1-IgG 抗體，觀察到疾病穩定的患者出現了MUC1 特異性反應[17]。臨床前研究的數據表明，用5-氟尿嘧啶、吉西他濱和γ 干擾素聯合治療方案可增加肝內膽管癌細胞中WT1 和MUC1 抗原的表達，從而為聯合治療提供了進一步的理論依據[18]。未來的Ⅱ期臨床實驗以及治療組合的應用將為肽疫苗的潛在益處提供更多的參考價值。

此外，在WT1 和MUC1 之外還研究了具有多肽抗原靶點的疫苗。在日本進行的一項Ⅰ期臨床試驗[19]中，研究者用淋巴細胞抗原6 復合位點K（lymphocyte antigen 6 complex locus K，LY6K）、TTK 蛋白激酶（TTK protein kinase）、胰島素樣生長因子ⅡmRNA 結合蛋白3（isulin like growth factor ⅡmRNA binding protein 3，IGF2BP3）和含DEP 結構域1（DEP domin containing 1，DEPDC1）的四肽疫苗治療9 例不可切除的膽管癌患者，其中78%的患者觀察到了肽特異性T 細胞免疫反應，除此之外，研究中還觀察到疫苗接種部位出現了局部的輕微皮膚反應，并在對預后因素的分析中得出，接種部位發生的局部皮膚反應以及肽特異性的CTL 誘導可能是無進展生存期和總生存期有利的預后因素[19]。同一組在日本東京開展的一項對晚期膽管癌患者進行的包括：細胞分裂周期相關蛋白（cell division cycle associated protein 1 ，CDC1）、鈣粘蛋白3（cadherin 3，CDH3）和驅動蛋白家族成員20A（kinesin family member 20A ，KIF20A）的三肽聯合疫苗Ⅰ期臨床試驗[20]顯示，這種三肽疫苗的耐受性良好，可在所有患者中觀察到肽特異性T 細胞反應，9 例患者中有5 例疾病穩定，但9.7個月的中位總生存期仍然很低。值得注意的是，疫苗注射部位出現的過敏反應可能是改善患者總生存期及預后的一種表現，因為這是體現免疫反應的表現[20]。可見Ⅱ期臨床試驗對于更好的確定這些肽疫苗聯合治療方案的安全性和有效性是必要的。Yoshitomi 等人[21]在晚期膽管癌患者中進行了個性化肽疫苗接種的Ⅱ期臨床試驗，根據疫苗接種前已存在的宿主免疫力，他們選擇了最多匹配4 種HLA 匹配的肽疫苗。這種個性化的多肽疫苗具有良好的耐受性，在第一個接種周期中17 名患者有8 名（47%）觀察到了T 細胞對疫苗肽的反應，緊接著在第二個接種周期后7 名患者有4 名（57%）也觀察到了T 細胞對疫苗肽的反應[21]。雖然這些免疫學數據表明肽疫苗治療的可行性和潛在的未來前景，但迄今為止對患者生存率的影響不是很大，因此下一步開展大規模的臨床實驗研究是非常有必要的。

肽疫苗治療的另一種替代方法是利用抗原脈沖刺激樹突狀細胞激活和上調特異性T 細胞反應。樹突狀細胞是功能最強的抗原提呈細胞，可誘導機體生成細胞毒性T 細胞，介導特異性抗腫瘤細胞免疫，因此樹突狀細胞在激活原始T 細胞和調節最佳的原始免疫應答中起著非常重要的作用。樹突狀細胞可被腫瘤相關抗原激活，試圖利用其自身特有的功能產生抗腫瘤T 細胞介導的免疫反應。應用WT1、MUC1 脈沖刺激樹突狀細胞疫苗治療65 例不可切除、復發或已有遠處轉移的膽管癌患者[22]，值得注意的是，那些接種疫苗后出現發熱的患者在多因素Cox 比例風險分析中提高了總生存期，由此我們推測這種免疫反應是對患者有益的[22]。盡管此研究顯示中表現出良好的耐受性，但整個研究所得到的客觀臨床結果仍不甚理想。研究中只有6%的患者出現了部分反應，接種疫苗后的中位總生存期為7.2 個月。Lepisto A J 等人[23]的Ⅰ期/Ⅱ期臨床研究使用了自體樹突狀細胞脈沖釋放MUC1 作為輔助治療接種于12 例原發腫瘤切除后的胰腺癌和膽管癌（2例）患者，結果顯示疫苗耐受性良好，未觀察到毒性反應，CD8+和CD4+T 細胞的活性也顯著增強。盡管有這些T 細胞反應，但接種疫苗后并沒有誘導抗-MUC1 抗體產生反應。33%的患者在切除手術后4 年內沒有復發的跡象以及26 個月的中位總生存期這些都是令人可喜的結果[23]。接種疫苗對于那些生存期較長的患者的具體影響尚不能確定，因為有許多患者也接受了輔助治療以及新輔助治療，不過膽管癌患者的數量少也是一個原因。對比疫苗聯合化療方案和單純化療方案或許能加深我們對這一方法的理解。

筆者認為今后應繼續尋找更多的靶向、特異性腫瘤相關抗原以期提高疫苗的療效。膜聯蛋白A2（Annexin A2）是一種已知在包括胰腺癌、乳腺癌、結腸癌和前列腺癌在內的多種癌癥中表達的抗原[24]。有研究報道與寄生蟲相關的膽管癌患者中膜聯蛋白A2 的表達上調[25]。這種蛋白被認為是一種與胰腺癌轉移相關的蛋白，因為其酪氨酸磷酸化與細胞表面易位已被證實與腫瘤侵襲和轉移的形成增加有關。在臨床前研究中，膜聯蛋白A2 通路抑制劑可致腫瘤的生長和轉移形成減少[26]。這只是作為改進膽管癌疫苗治療的可行的靶點之一，未來仍然還有很多可行的靶點值得我們去探索，同時也需要得到大量臨床前研究的輔助。

3 過繼性T 細胞治療

增加宿主腫瘤特異性免疫應答和腫瘤內T 細胞浸潤的另一種方法是將患者自身的TIL 輸注回患者體內[27]。過繼性T細胞移植產生的腫瘤微環境中活化的細胞毒性T 淋巴細胞的數量比疫苗單獨誘導產生的有所增加，Dudley 等人的研究指出在轉移性惡性黑色素瘤中輸注富含CD8+的TIL58%的患者（包括3 名完全應答者）反應出客觀的療效[28]。通過過繼性免疫療法直接轉移細胞免疫也被研究用于膽管癌聯合樹突狀細胞疫苗。

Higuchi 等人[29]報告了1 例肝內膽管癌伴淋巴結轉移陽性的患者，在手術后通過CD3 激活的T 細胞和腫瘤裂解產物脈沖樹突狀細胞治療后患者獲得了3 年6 個月的長期生存時間。Tran 等人[30]報道了1 個伴有廣泛遠處轉移的膽管癌病例，在該病例中他們采用了全基因組測序的方法測定了非同步性的基因突變，這些突變的基因被單獨轉染到APCs 中，并與患者的TILs 共同培養以獲得最佳反應性。在治療后7 個月內這些特異反應性T 細胞得到了擴增和轉移導致腫瘤消退[30]。這些研究案例充分顯示了過繼性T 細胞治療策略的可行性，并以此有了后續更大規模的前瞻性試驗作為ICC 患者術后的輔助治療[31]。該研究共選取36 例ICC 患者接受了活化T 細胞移植且接種了自體腫瘤裂解產物脈沖樹突狀細胞，結果接受輔助免疫治療的患者中位無進展生存期為18.3個月，而僅接受手術治療組的的中位無進展生存期為7.7 個月（P=O.005）。同樣的接受輔助免疫治療患者的總生存期為31.9 個月，而未接受輔助免疫治療的手術治療組的總生存期為17.4 個月（P=0.002）[31]。但筆者認為，為了證實過繼性T細胞移植聯合樹突狀細胞疫苗作為ICC 輔助治療的臨床療效，下一步有必要開展臨床Ⅲ期試驗。

4 免疫檢測點抑制劑

人體免疫系統中有一類特殊的淋巴細胞——T 細胞，在免疫過程中扮演者不可或缺的角色。為了維持免疫系統的穩定性，T 細胞的活化受到多重調控，目前的主流機制認為T細胞的活性受到正負雙重信號的調節：首先，T 細胞上的受體（T cell receptor，TCR）識別APCs 上的主要組織相容性復合物（major histocompatibility complex，MHC）呈遞的抗原后初步活化，隨后，APCs 或T 細胞上表達的共刺激分子或共抑制分子與TCR 結合，是T 細胞徹底活化或失活。也就是說，第一信號是T 細胞活化的“開關”，而共刺激分子和共抑制分子才是決定T 細胞活化的關鍵因素[32]。在正常生理情況下，共刺激分子與共抑制分子處于相對平衡狀態，保證了T 細胞的適度活化，維持著免疫系統的穩定。

共抑制分子又稱免疫檢測點（immune checkpoint），其中最受關注的主要是程序性死亡蛋白-1（programmed deathprotein-1，PD-1）和細胞毒性T淋巴細胞抗原-4（cytotoxic T-lymphocyte-associated protein4,CTLA-4）,這些免疫檢測點一旦與其相應的配體（PD-L1 和CD152）相結合后會導致T細胞增殖減少并引發T 細胞耗竭和細胞凋亡，因而腫瘤細胞可利用此途徑發揮其腫瘤免疫逃逸機制，盡管如此，若能抑制這些受體與配體的結合就可以增強T 細胞潛在的抗腫瘤免疫活性[33]。

PD-1/PD-L1 途徑在腫瘤微環境的發展中起著非常重要的作用。腫瘤細胞、APCs 和基質細胞表面表達的PD-L1 與T 細胞表面的PD-1 結合并相互作用從而引發T 細胞衰竭、凋亡[34,35]。由于腫瘤過度表達PD-1/PD-L1 途徑從而導致T 細胞無能并降低其效應器活性[36]。兩種經FDA 批準的單克隆抗 體pembrolizumab(KEYTRUDA) 和nivolumab(OPDIVO) 已被開發上市，用于阻斷PD-1 及其配體之間的相互作用。這種免疫檢測點抑制劑已在治療黑色素瘤和非小細胞肺癌等多種腫瘤類型上取得了巨大的成功[37,38]，極大地改變了這些疾病的自然史。然而在晚期胃腸道惡性腫瘤中，除了微衛星不穩定（microsatellite unstable，MSI-H）的結直腸癌以外，單藥PD-1 抑制劑治療在很大程度上是無效的[38]。

臨床前數據表明，在膽道腫瘤患者中靶向免疫檢測點抑制劑的應用前景是可觀的。有多項研究采用免疫組織化學染色（immuneohistochemistry,IHC）的方法觀察ICC 患者腫瘤細胞中PD-1/PD-L1 的表達以及炎性細胞聚集的情況，此外，研究者發現PD-1/PD-L1 表達上調的腫瘤患者往往與其較短的總生存期有關，這也提示這些腫瘤患者中的部分人群或許是免疫檢測點抑制劑應用的備選者[39-42]。在Gani 等人[40]的研究中已證實膽管癌患者的腫瘤切緣處PD-L1 的表達與其低生存率有關。Sabbatino 等人[39]報道ICC 標本中幾乎100%表達PD-1/PD-L1，他們還發現淋巴細胞浸潤并表達活化了的HLA Ⅱ類抗原被認為是抗腫瘤T 細胞介導的免疫應答的證據。盡管PD-1/PD-L1 單獨表達似乎與臨床結局無關，但研究者發現與PD-L1 表達陽性、HLA Ⅰ類抗原低表達或不表達或兩者都表達相比，那些PD-L1 低表達或不表達但同時HLA Ⅰ類抗原高表達者，與ICC 患者總生存期的顯著延長相關[39]。這些研究結果為今后更詳細地探究膽管癌中免疫檢測點的表達對膽管癌患者預后的影響提供了理論基礎，同時也為今后在膽管癌中應用免疫檢測點抑制劑療法的評價提供了初步探索的途徑。一項臨床Ⅱ期試驗KEYNOTE-158[43]對PD-L1 表達陽性的晚期膽管癌患者使用PD-L1 抑制劑pembrolizumab 進行單藥治療，研究共納入了經組織學和病理學證實為晚期不可切除的且PD-L1 表達陽性的膽管癌患者共104 例，患者每三周服用200mg 的pembrolizumab，用藥時間均未超過2 年，根據實體瘤療效評價標準（RECIST1.1）確定其主要療效終點是客觀緩解率（ORR），隨訪時間的中位數為7.5 個月，ORR 為5.8%，中位總生存期和中位無進展生存期分別為7.4 個月和2.0 個月，有13.5% 的患者出現了3～5 級的藥物不良反應事件；而在之前2015 年進行的KEYNOTE-028 臨床Ⅰb 期試驗中[44]，對納入的24 例PD-L1表達陽性的晚期膽管癌患者服用pembrolizumab10mg/kg 每兩周一次，用藥時間均未超過2 年，同樣根據RECIST1.1 確定其主要療效終點為ORR，隨訪時間的中位數為5.7 個月，得出在KEYNOTE-028 試驗中ORR 為13.0%、中位總生存期和中位無進展生存期分別為5.7 個月和1.8 個月、有16.7%的患者出現了3-5 級的藥物不良反應事件。總之，我們最終可以看出，無論PD-L1 的表達如何，晚期膽管癌患者使用pembrolizumab 的耐受性良好，且顯示出了其持久的抗腫瘤活性以及可控制的藥物毒性。

此外，另一組臨床實驗[45]在膽管癌的免疫檢測點抑制劑治療方面也表現出了療效顯著的應用前景，不同的是，此研究有部分患者存在錯配修復缺陷（mismatch repairdeficiency，dMMR）。這項Ⅱ期臨床試驗評估了PD-1 抑制劑pembrolizumab 單抗在單藥治療晚期轉移性腫瘤中的療效，并在dMMR 患者中觀察到了反應持久的藥物治療效果。雖然這項研究納入的主要是結直腸癌患者，但其中一部分dMMR的非結直腸癌患者（包括4 例膽管癌）也表現出了相似的治療效果，其中ORR 為71%,無進展生存率為67%。然而，這種基因突變僅代表不常見疾病中的一類罕見的疾病亞型，因此對這一孤立的群體研究具有挑戰性。

盡管PD-1/PD-L1 免疫檢測點抑制劑已成為當下治療膽管癌的研究熱點，但靶向抑制多個附加受體如：T 細胞免疫球蛋白黏蛋白-3（T cell immunoglobulin and mucin domaincontaining 3 ，TIM-3）、吲 哚 胺2,3 雙 加 氧 酶（indoleamine 2,3-dioxygenase ，IDO）和淋巴細胞活化基因-3（lymphocyte activation gene 3 ，LAG-3）等途徑也正被應用于包括膽管癌在內的胃腸道惡性腫瘤的研究中[46-49]。這些細胞信號通路的共同特點都是被腫瘤細胞“劫持”以抑制效應細胞的增殖、活化，從而降低效應細胞的功能或引發細胞死亡。臨床前研究均詳細闡述了這些信號途徑在膽管癌中的表達情況及對臨床治療效果的影響，未來這些信號途徑可能會為膽管癌的治療提供新的研究方向并為膽管癌的聯合治療提供額外的理論基礎。在一些由免疫原性導致的惡性腫瘤如在黑色素瘤中聯合應用免疫檢測點抑制劑已經取得巨大的成功[50-52]。盡管如此，在膽管癌中應用免疫檢測點抑制劑治療的相關報道還相對較少。

腫瘤的免疫療法最早應用于晚期伴有遠處轉移的實體瘤患者，目前，腫瘤的免疫療法早已發展到應用于可切除腫瘤的患者[53]。在此情況下，臨床前研究表明腫瘤患者應用免疫治療的時機顯得尤為重要。新輔助免疫檢測點治療與單純輔助治療相比，在臨床前研究的動物模型試驗中，新輔助免疫治療的治療效果更為明顯[54]。但是，還需要在膽管癌中開展進一步的臨床研究以證實這一試驗結果。

5 展望

免疫療法在膽管癌中的應用前景仍不甚明朗，但越來越多的實驗證據表明，由于膽管癌的發病機制中有免疫因素的成分參與，因此未來的研究者們值得在膽管癌的免疫治療方面做出更多的努力，或許在不久的將來免疫療法能夠成為膽管癌的一種非常有效的治療方案。開展更大規模的臨床研究以證明膽管癌免疫治療的有效性以及如何優化現有的治療方案將是我們接下來的工作重心，同時我們還應致力于探索出膽管癌新的治療靶點和最佳治療方案的組合。

最后，筆者認為免疫治療是否可應用于所有晚期膽管癌患者可能性不大，但是其某個特定的疾病亞型或許對某個特定的靶向治療（包括過繼細胞治療、樹突狀細胞脈沖疫苗治療或免疫檢測點抑制劑治療）會顯示出良好的治療效果。因為對于那些有錯配修復基因功能缺陷疾病的患者，已經顯示出了免疫檢測點抑制劑單藥治療的持久反應，具有非常客觀的臨床治療效果[45]。隨著我們對基因突變的了解不斷深入，識別腫瘤對免疫治療做出反應的能力也將會有所提高。有研究表明近40%的膽管癌被發現有潛在的靶向基因改變，比如FGFR2、PRKACA 和ERBB2 基因，這表明未來在膽管癌中應用靶向分子抑制劑具有潛在治療意義[55]。此外，該研究還發現具有高突變負荷和相應的免疫檢測點分子過度表達的腫瘤患者預后最差[55]。因此，對于那些具有特定基因改變的膽管癌亞型來說，或許可為將來的小分子抑制劑聯合免疫檢測點抑制劑療法在膽管癌中的應用提供了可能的機會[56]。全面的基因組分析或許有助于膽管癌的精準治療并可能為晚期膽管癌患者的個體化治療提供可喜的前景。

總之，隨著基因工程、分子生物學、基因組學以及腫瘤免疫學等學科的發展，相信在不久的將來，國內外研究者對膽管癌免疫治療研究的不斷深入，并與腫瘤的放化療、分子靶向治療等聯合，那么終有一天膽管癌患者的免疫治療將會迎來新的曙光！