外泌體與喉癌干細胞的研究進展

王正，衛旭東

(1.甘肅中醫藥大學，甘肅 蘭州 730000；2.甘肅省人民醫院 耳鼻咽喉-頭頸外科，甘肅 蘭州 730000)

0 引言

喉癌是頭頸部腫瘤中常見的腫瘤之一，對喉癌的治療有手術和放化療、生物治療等，但其較高的復發和轉移仍然是一大難題。迫切需要尋找其他新型有效的治療方法，近年來，腫瘤干細胞理論的提出及外泌體的發現給我們帶來了新的啟發,可提供新的思路開發新的喉癌治療方法。

1 腫瘤干細胞

1.1 腫瘤干細胞概念、來源與生理

腫瘤干細胞是一種能夠產生異質腫瘤細胞的自我更新細胞[1]。傳統的觀點上，腫瘤是由體細胞突變而成，每個腫瘤細胞都可以無限制地生長，但這并不能完全解釋其無限增殖的能力。有研究表明，腫瘤細胞中只有一小部分細胞才能在移植后成為腫瘤[2]，這跟干細胞的特性相似。因此，有學者[3]提出腫瘤干細胞理論(tumor stem cell,TSC),該理論認為腫瘤細胞中存在著極少量具有無限增殖能力、可自我更新及多向分化潛能的腫瘤干細胞，對于腫瘤細胞無限增殖、復發和轉移提供了理論依據。這一理論也讓我們重新認識腫瘤發生和發展，以及對于臨床治療腫瘤提供了新的研究方向和方法。

對于腫瘤干細胞有多種學說來解釋來源，但比較認可的有兩大觀點。其中有一個學說認為, 腫瘤干細胞的起源是由于各種因素的作用下正常干細胞發生的基因突變等等原因所轉變而來。因此腫瘤干細胞與正常干細胞的特性特別相似,由同樣的信號通路介導細胞自我更新、增殖和分化等等[4]。在一些腫瘤中，一些學者們通過研究也證實了腫瘤干細胞來源于正常干細胞的突變[5]。但還有一種學說認為，腫瘤干細胞來源于祖細胞，祖細胞是一種來源于干細胞的早期分化類型, 相較于干細胞它有更為定向的細胞特征, 比如較低的自我更新能力以及有限的復制性[6]。關于祖細胞的特性, 很多研究顯示它可以分化成為腫瘤干細胞。一個正常的祖細胞,經過誘導后可以分化成多種家系的腫瘤干細胞[7]。雖然有多種觀點來解釋腫瘤干細胞的來源，但不管是從體細胞還是祖細胞來源，兩者都有其共同點，都支持腫瘤干細胞可以自我更新及無限增殖。

腫瘤干細胞跟正常干細胞一樣都具有自我更新和多向分化的能力[8]。腫瘤干細胞對腫瘤的存活、增殖、轉移及復發等都有著很重要的作用。腫瘤干細胞通過自我更新和無限增殖維持著腫瘤細胞群的生命力，腫瘤干細胞的運動和遷徙能力又使腫瘤細胞的轉移成為可能[9]。有研究表明腫瘤干細胞同時也會對放療或化療產生耐藥性，例如，其可以增強對DNA損傷識別和修復的能力, 從而使其存活，產生化療抗性[10]。有研究表明腫瘤干細胞可以通過不同機制耐藥[11]。常規的腫瘤治療方法，如化療只能消滅一小部分腫瘤細胞，然而對腫瘤干細胞的殺傷不足，腫瘤往往在治療一段時間后復發。因此大部分腫瘤的治療失敗的原因可歸咎于腫瘤干細胞的存在。因此未來治療腫瘤的新方向是找到腫瘤干細胞特異性治療靶點。

1.2 喉癌腫瘤干細胞的研究現狀

腫瘤干細胞最早在白血病的研究中發現[12]，而后在許多惡性腫瘤中都相繼發現了腫瘤干細胞的存在，如在喉癌細胞中證實了喉癌干細胞的存在[13]。喉癌腫瘤細胞中的喉癌干細胞數量很少，但其卻是喉癌復發、轉移甚至耐藥的主要原因，對于喉癌干細胞主要的研究方向是對其表面標志物或通過其相關信號通路來達到抑制喉癌干細胞的目的。因此對喉癌干細胞的研究有助于治療或預防喉癌。有研究團隊通過研究以Hep-2 喉癌細胞系及喉鱗狀細胞癌實體瘤為研究對象，研究喉癌干細胞的生物學特性及自我更新機制。研究并首次證實了喉癌組織細胞中，CD133+Hep-2 細胞具有強的增殖、侵襲能力及克隆形成能力，對放化療有抵抗性，具有干細胞特性[14]；CD133+腫瘤干細胞中，抗凋亡基因表達上調，是CD133+Hep-2 細胞自我更新的物質基礎，干細胞相關信號通路Wnt、Hedgehog 以及Bmi-l 信號通路處于活化狀態，靶向這些信號通路，有望有效殺傷喉癌干細胞,在喉癌實體瘤干細胞中，Bmi-1 通過抑制下游INK4a/ARF 基因轉錄及P16ink4a/P14ARF 蛋白表達調控喉癌實體瘤干細胞自我更新，Bmi-1 基因有望是喉癌干細胞靶向治療新的位點[14]。

研究中發現喉癌干細胞的表面標志物有CD133[13]、CD44[15]、ALDH-1[16,17]等。有研究表明這些標志物對腫瘤信號轉導、腫瘤免疫逃逸、藥物耐受和放療抵抗均有相關性[18]，這些標志物有可能成為新的喉癌干細胞治療靶點。有研究表明RNA 干擾TRAP1 表達抑制CD133～+CD44～+喉癌干細胞生長并促進凋亡[19]等。

喉癌干細胞的形成及轉化是多種信號通路共同作用的結果。喉癌自我更新相關的Hedgehog 信號通路、Wnt 信號通路及Bmi-l 通路[14]。因此尋找有效的信號通路，并通過其抑制喉癌干細胞是一大研究熱點。例如，RGD 肽可以通過抑制VEGF 介導的STAT3/HIF-1α 通路而抑制喉癌干細胞[20]。或者通過某一信號通路來增強藥物發揮的功效，例如順鉑在很多腫瘤包括喉癌都有作用，而有研究發現IL-6 的核糖核酸干擾抑制通過下調IL-6/STAT3/HIF1 通路增強順鉑在喉癌干細胞中的功效[21]。

在喉癌干細胞的研究中，不論通過發現喉癌干細胞的表面標志物，進而識別標志物再達到精準的靶向治療，還是通過其信號轉導通路來直接抑制喉癌干細胞或增強藥物的功效都是我們取得的一些成果。

2 外泌體

2.1 外泌體概念

外泌體是起源于核內體、大小為 30 ～ 100nm 的細胞外囊泡,最早在研究網織紅細胞成熟為紅細胞過程時發現了外泌體[22]，不過當時人們認為外泌體的作用只是將代謝垃圾從細胞內運出細胞外而未給予足夠的重視。直到1996 年,Raposo等人發現外泌體具有呈遞抗原,并刺激T 細胞增殖的作用[23],而受到關注并開始研究。

外泌體內包含有許多的生物活性物質，如蛋白、核酸及脂類等[24]。除了某些特殊的細胞外幾乎所有細胞都釋放外泌體，,包括血液、唾液、尿液、腦脊液等[25]體液中廣泛存在。外泌體作為細胞間物質交換的載體，介導細胞-細胞間通訊，參與機體各種生理及病理過程[24]，對生物有重要的生理意義。

2.2 外泌體的提取及生物特性

外泌體可攜帶多種蛋白質、mRNA、miRNA，參與細胞通訊、細胞遷移、血管新生和腫瘤細胞生長等過程[26]。而來源于不同細胞的外泌體其對受體的作用也大有不同，在機體內可發揮不同的作用。例如，研究表明外泌體不僅在正常細胞內發揮作用也會對腫瘤細胞的生長發育產生影響[27]。有研究表明外泌體與靶細胞的識別具有特異性，如血小板來源的外泌體能識別內皮細胞和巨噬細胞，不能識別中性粒細胞[26]；而中性粒細胞來源的外泌體則可識別血小板、巨噬細胞及樹突狀細胞等[26]，而這對利用外泌體來研制靶向藥物提供了可能性。對外泌體的提取中仍沒有一種方法能同時保證外泌體的含量、純度、生物活性等[26]。如何開發高效、快速、穩定, 并且能完整保留其結構和生物功能的方法, 是目前外泌體能應用于臨床的基礎及前提,目前常用的提取方法一般有離心法、超濾法、免疫法、沉淀法等[28]。

2.3 外泌體與喉癌腫瘤干細胞

2.3.1 外泌體與腫瘤干細胞

外泌體在腫瘤診斷和治療上也有很大的作用。而且同細胞分泌的外泌體的功能不盡相同，使用不同細胞來源外泌體診斷或治療疾病及腫瘤被廣泛研究，如，間充質干細胞外泌體增強牙周韌帶細胞功能促進牙周再生[29]。尿外泌體在腎臟疾病中的研究[30]、外泌體在心血管疾病方面的研究[31]等。利用不同來源外泌體診斷治療腫瘤是最近的研究熱點。除了利用外泌體本身之外，有研究表明，依靠外泌體的特性, 可將外泌體作為一種載帶核酸、化學、蛋白質類藥物的載體[32]。相關的研究中已經表明此種方法的可行性。近年來, 在腫瘤靶向治療中，由于外泌體來源廣泛、納米尺寸和良好的生物相容性，許多研究人員成功地從不同細胞中構建了作為治療性載體的一種靶向治療方式[33]。不論使用外泌體本身的特性還是改造外泌體作為載體治療疾病都是未來的研究方向。

腫瘤細胞自身也可分泌外泌體，并進入機體發揮雙向調控作用，不僅促進腫瘤發生發展，同時對其發生及發展也可產生抑制作用。其外泌體及其分泌的各種生物學物質，均可在腫瘤細胞的發生發展過程中起重要的生理作用。例如，在腫瘤發生、發展、轉移、惡化和免疫逃逸過程中起到很重要的作用[34]。

有學者發現腫瘤細胞來源的外泌體對腫瘤生長具有促進作用[35,36]。一項研究報道中，給予預先種植卵巢癌細胞的小鼠的腹腔內注射從卵巢癌患者腹腔積液中分離出的外泌體，可以明顯促進小鼠腹腔內腫瘤的生長[35]。而腫瘤分泌的外泌體促進腫瘤生長是通過不同的途徑來進行的，如乳腺癌外泌體通過抑制NK 細胞功能促進腫瘤生長[36]等。外泌體不僅對腫瘤有促進作用，也有抑制作用。有研究表明間充質干細胞來源的外泌體可以抑制腫瘤的增殖，例如來自骨髓間充質干細胞的外泌體含有促進轉移性乳腺癌細胞休眠的microRNA[37]。

腫瘤外泌體能促進腫瘤的轉移，在腫瘤的轉移中通過不同的途徑發揮著其獨特的作用。腫瘤外泌體內含的多種物質對腫瘤的轉移有一定的影響。有研究表明來自高轉移細胞的外泌體miRNA 可誘導低轉移細胞的轉移[38]。同時腫瘤干細胞外泌體可以通過促進間充質干細胞的增殖、遷移和侵襲等生物學行為來促進腫瘤遠處轉移[39]。近來研究中發現外泌體在腫瘤的上皮間質化過程中可以起到一定作用[40]，而上皮間質化在腫瘤的轉移的過程中發揮著重要作用。總之，不同來源外泌體包括腫瘤來源外泌體在各種不同腫瘤中的作用有待進一步的深入研究。

2.3.2 外泌體與喉癌腫瘤干細胞

外泌體與腫瘤干細胞包括喉癌干細胞，既有促進也有抑制的作用。同時腫瘤干細胞自身也會分泌外泌體，對腫瘤細胞產生調控作用如高表達ANXA2 的肝癌干細胞的外泌體對肝癌細胞惡性生物學特性具有調控作用[41]。同時其對腫瘤干細胞自身或腫瘤細胞產生雙向的調控作用。例如，有研究表明腫瘤樣干細胞Piwil2-iCSC 外泌體能促進人臍帶間充質干細胞的增殖、遷移及侵襲[39]。而在抑制性作用方面，喉癌Hep-2 細胞來源外泌體能成為樹突細胞（DC）并刺激T細胞增殖而抑制喉癌細胞生長[42]等。喉癌細胞或喉癌干細胞來源外泌體其內部富含豐富的信息物質包括癌細胞信息，如mRNA、miRNA 等，這讓其成為新的喉癌腫瘤標記物成為可能，當其被分泌到體液中時可通過對其檢測得到一定的腫瘤信息。例如Joseph 等[43]研究使用表面增強拉曼光譜法對外泌體進行分析檢測胰腺癌。還有研究表明可通過直接評估外泌體的蛋白質含量來區分具有不同上皮和間充質表型的乳腺癌亞型[44]。也有研究表明對喉癌患者血清中外泌體miRNA-21 和HOTAIR 的檢測可以作為喉癌患者診斷的標志物[45]。同時外泌體因其生物特性可以成為藥物載體，在靶向治療中發揮作用。例如，外泌體可以裝載siRNA,miRNA,相關蛋白以及小分子化合物等,具有抗腫瘤特性外泌體被傳遞到靶組織發揮治療作用[46]。有研究通過外泌體較高的血清穩定性、毒性低、易通過各種屏障、較高的生物相容性和較低的免疫原性等特性治療乳腺癌[47,48]，進一步研究發現載藥腫瘤細胞外泌體對CD133+乳腺癌腫瘤干細胞具有一定的抑制作用[49]。而CD133+也是喉癌腫瘤干細胞標志物質之一，腫瘤細胞外泌體對喉癌腫瘤干細胞是否有抑制作用有待于進一步的研究。綜上所述，對外泌體進行一定的改造或可以成為喉癌治療的重要靶點和工具。

目前腫瘤干細胞和外泌體的研究已經取得了一些成果，例如發現外泌體對腫瘤干細胞的調控作用，或者通過對外泌體的檢測來達到對腫瘤的檢測，如檢測外泌體miRNA-21 和HOTAIR 的檢測以發現喉癌[45]等。來源不同的外泌體的功能也不盡相同，因此許多研究者致力于研究來源不同的外泌體的功能及其在可以腫瘤中發揮的作用。例如由腫瘤干細胞來源的外泌體對自身腫瘤的調控作用和外泌體跟腫瘤干細胞之間相互平衡的關系同樣也是研究的熱點。對于外泌體和腫瘤干細胞之間更深入相關性有待于進一步的研究。

3 總結

近年來，對腫瘤干細胞和外泌體的研究日益增多，對于外泌體的生物學作用及其在腫瘤的發生發展中作用的研究取得了一定的進展。幾乎所有細胞包括腫瘤干細胞都會分泌外泌體，對外泌體的檢測或可以成為新的腫瘤標志物檢查方法，對腫瘤的早期發現、診斷和治療有重要意義。而外泌體不僅對腫瘤的發生和發展有促進作用也有其抑制的作用。外泌體可以對腫瘤的治療提供新的靶點和診療思路，而腫瘤干細胞對腫瘤的發生發展有著重要的意義，研究腫瘤干細胞和外泌體的相互作用，利用外泌體本身或其他方法去治療腫瘤是研究的熱點之一。目前外泌體已經在多種疾病的檢測及治療中都發揮了重要作用。雖然外泌體很有研究價值，但對于任何一種新的事物我們都應該更加的慎重，嚴格對其驗證和測試，應對外泌體進行更多更深入的研究。