內質網應激及其與腫瘤能量代謝關系的研究進展

蘇天宇， 黃滔， 吳志浩

（1.皖南醫學院臨床醫學院， 安徽 蕪湖241002； 2.腫瘤微環境研究室； 3.基礎醫學院）

內質網 （endoplasmic re?ticulum， ER） 通常被認為是負責調節蛋白質、 脂質和類固醇合成以及鈣依賴性信號轉導的細胞器。 在正常情況下， 正確折疊的蛋白質會通過分泌途徑被轉運至其指定的細胞位置。 但是在各種病理因素下，可引起蛋白質的錯誤折疊， 從而導致內質網應激（endoplasmic reticulum stress， ERS）。 當ER 腔中的錯誤折疊的蛋白質超過ER 自身降解或處理能力時， 過度積累的畸形蛋白就會引起未折疊蛋白反應（unfolded protein response， UPR）［1-2］。 在適度的ER 壓力下， UPR 可以作為促生存機制發揮作用， 使細胞恢復到穩態。 然而， 當細胞損傷超過了這種適應性反應的能力時， UPR 的持續激活會使細胞啟動凋亡程序， 導致細胞的凋亡［3］。 腫瘤通過重新編程營養物質獲取和代謝的途徑， 以滿足惡性細胞生物能量、 生物合成和氧化還原的需求。 這些重新編程的活動現在被認為是腫瘤的標志。 與正常細胞代謝不同， 腫瘤細胞即使在有氧的情況下， 仍通過糖酵解途徑產生大量乳酸， 這種現象被稱為Warburg 效應［4］。 這種糖酵解通量的增加是腫瘤細胞的代謝策略， 以確保腫瘤細胞在低氧濃度的環境中的存活和生長。 然而， 現在越來越多的研究表明， ERS 與腫瘤代謝的調控密切相關。 本文旨在對ERS 在腫瘤中的作用及揭示其與腫瘤代謝之間的關系作一綜述。

1 ERS 與UPR

UPR 有3 種信號轉導途徑， 這些途徑由3 種各自的ER 跨膜蛋白調控： 肌醇需求酶1 （inositol-requiring enzyme 1， IRE1）、 轉 錄 活 化 因 子6（activating transcription factor 6， ATF6） 以及蛋白激酶樣內質網激酶（protein kinase-like ER kinase ，PERK）［5］。 在正常細胞條件下， PERK、 IRE1 和ATF6 與ER 中免疫球蛋白結合蛋白 （binding immunoglobulin protein， Bip） 形成穩定的復合物，使活性處于抑制狀態［6］。 Bip 結合到ER 腔中的結構域上， 阻止了PERK 和IRE1α 的二聚化和磷酸化。 BiP 與ATF6 的結合會阻斷其轉運至高爾基體， 從而使ATF6 保留在ER 膜上， 阻止ATF6 的進一步加工［7］。 在細胞應激的狀態下， ER 中不斷積累錯誤折疊的蛋白質競爭性結合Bip， 導致Bip與PERK、 IRE1α 和ATF6 分離， 從而消除了其抑制作用， UPR 途徑便會被激活來緩解ER 腔中錯誤折疊蛋白的負荷。 這個多途徑的過程包括了減少核糖體活性的機制和增加ER 蛋白折疊能力的機制。 同時， ER 識別出末端錯誤折疊的蛋白質， 并通過ER 相關降解（endoplasmic reticulum-associated degradation， ERAD） 系統降解。 如果這些保護過程失敗并且不能消除ER 壓力， 則會激活細胞的死亡途徑［3，8］。

2 UPR 信號通路

2.1 Bip 是UPR 信號通路的主要調節器 Bip 也稱為葡萄糖調節蛋白 78 （glucose - regulated proteins， GRP78）， 在ERS 的適應性反應中起主要作用， 并且常在乳腺癌、 肺癌［9］、 前列腺癌和其他惡性腫瘤中都呈現高表達狀態。 PERK、 ATF6和IRE1α 構成跨膜受體， 與結合的Bip 形成無活性、 穩定的復合物［10-11］。

PERK、 IRE1α、 ATF6 在UPR 信號通路3 個中央分支的激活中起關鍵作用。 并且， PERK 被認為是UPR 信號通路的主要調節因子， 它決定了細胞的命運， 控制細胞是否會發生凋亡。 Bip 常作為折疊酶， 防止錯誤折疊的蛋白質進一步運輸或積累， 從而抑制UPR 信號轉導通路的激活［12］， 當錯誤折疊的蛋白質與Bip 結合時， PERK、 IRE1α、ATF6 便從復合物中解離出來， 導致3 個傳感器的磷酸化并激活其各自的UPR 信號通路。 每個分支都具有其獨特的下游靶標， 它們會判定ER 中的壓力情況， 根據ER 是否能代償壓力來切換決定性的分子機制。 Bip 既可以作為UPR 的正調節劑， 也可以作為負調節劑， 這表明Bip 在細胞對ERS 的適應性發展中起著重要作用。 在ERS 時Bip 僅在達到合成極限之前才進行適應。 在嚴重或長時間的ERS 條件下， Bip 無法抑制UPR 活化， BAX、BAK、 BH3 凋亡信號會依次被不可逆地激活［13］。

2.2 PERK 介導的UPR 信號通路激活的分子機制

PERK 是一種定位在ER 的跨膜蛋白， 屬于Ⅰ型跨膜激酶， 由ER 腔中的N 端應力感應結構域和胞質C 端的絲氨酸／蘇氨酸蛋白激酶結構域構成。 當觸發ERS 后， BiP 與PERK 發生解離， 導致其二聚化、 自身磷酸化和活化。 隨后， eIF2α 發生PERK 依賴性磷酸化， 使ER 腔中mRNA 翻譯被短暫阻斷， 從而減少了ER 對蛋白質折疊。 同時， 磷酸化的eIF2α 還通過加速細胞周期蛋白D1 的消耗而引起細胞周期的停滯， 并選擇性增強特定mRNA的翻譯， 包括ATF6、 轉錄激活因子4 （ATF4）、X-box 結 合 蛋 白1 （XBP1）、 C／EBP 同 源 蛋 白（CHOP） 以及細胞凋亡抑制蛋白1 和2 （cIAP1／2）［14-16］。 ATF4 在促生存基因的轉錄調控中起關鍵作用， 主要與氧化應激、 自噬、 蛋白質折疊、 氨基酸合成和細胞分化有關［17］。 因此， ATF4 構成了氧化和代謝穩態的關鍵介質， 主要促進細胞存活［18-19］。 p-eIF2α 上調的其他蛋白質， 例如血管內皮生長因子A （VEGF-A） 或生長停滯和DNA損傷誘導蛋白GADD34 （在負反饋回路中使p-eIF2α去磷酸化） 被認為是克服細胞應激的關鍵［20］。 后者作為ATF4 靶標之一被ATF4 和PERK下游的CHOP 直接激活， 導致生長停滯和整體蛋白質合成恢復［21］。 相關研究發現， PERK 依賴性UPR 信號的激活， GRP78、 p-PERK、 p-eIF2α 和CHOP 表達的升高可能證實了這一途徑［22］。 因此，選擇性地誘導許多編碼ER 伴侶蛋白和酶的基因的轉錄， 對修復壓力造成的損傷和處理過量的未折疊蛋白至關重要。 否則， 總轉錄速率的降低會使得細胞發生凋亡［20］。

2.3 IRE1α 受體在決定細胞命運中的雙重功能IRE1 有IRE1α 和IRE1β 有兩種常見的同工型，IRE1α 在各類組織中普遍表達， 而IRE1β 在組織中表達受限［23-24］。 IRE1α 是Ⅰ型跨膜絲氨酸／蘇氨酸蛋白激酶， 具有位點特異性核糖核酸內切酶活性。 在ER 穩態時， IRE1α 與BiP 的物理相互作用會抑制其自身活性。 在ERS 時， IRE1α 單體發生聚合， 觸發自身磷酸化使構象變化， 最終激活RNase 結構域［25］。 其隨后與TNF 受體相關因子2（TRAF2） 的相互作用導致激活主要的促凋亡介質如JNK 和Caspase-12 蛋白［11，26］。 RNase 結構域可以啟動2 個不同的下游UPR 信號轉導途徑： 分別通過XBP1 mRNA 的非常規剪接或通過IRE1α 依賴性 衰 變 （regulated IRE1α - dependent decay，RIDD） 途徑促進的多種底物的轉錄后修飾［25，27］。由IRE1α 剪接的XBP1 進入細胞核以誘導UPR 靶基因的轉錄， 進而引發適應性反應， 包括ER 伴侶蛋白的上調和ERAD 泛素化機制的啟動。 此外，活化的XBP1s 與缺氧誘導因子1α （HIF1α） 二聚化， 從而增強缺氧應答基因的表達， 如血管生成的關鍵因子VEGF-A［28］。 此外， XBP1s 可能會增強過氧化氫酶的表達， 其丟失可使細胞對應激誘導的細胞凋亡敏感。 這可能與細胞中過氧化氫酶缺乏、 ROS 的產生和p38 活化相關［29］。 然而， 不可逆的ER 壓力條件下， XBP1 mRNA 的剪接停止，IRE1α 將激活RIDD 途徑進行選擇性切割來降解與ER 相關的蛋白的mRNA［30］， 這對促進細胞存活至關重要。 但是， 一旦ERS 加劇， RIDD 可能通過增強編碼mRNA 的生存蛋白的降解來促進細胞死亡。然后凋亡啟動蛋白caspase-2 會被激活， 直接導致線粒體依賴性細胞凋亡［31］。 有研究表明， ATF6 和PERK-ATF4 信號軸通過2 種獨立機制激活IRE1α-XBP1 途徑來促進XBP1s mRNA 的生成。 這種相互作用可以使細胞通過IRE1α-XBP1 途徑來調控和適應各種類型和水平的應激［32］。 相反， IRE1α缺乏會通過PERK 依賴性自噬引起eIF2α 表達的降低， 從而導致細胞死亡增加［33］。

2.4 ATF6 在恢復ER 穩態中的重要作用 ATF6是堿性亮氨酸拉鏈轉錄因子， 有2 種同工型即ATF6α 和ATF6β［32］。 當ERS 時， ATF6 從ER 中被釋放出來， 運送至高爾基體中。 在高爾基體內，ATF6 被蛋白水解酶S1P 和S2P 依次水解， 產生暴露氨基端部分的具有活性的轉錄因子ATF6（p50）［16］。 然 后， 經 切 割 的 ATF6 轉 錄 因 子（ATF6 p50） 進入細胞核， 以調節UPR 靶基因的轉錄， 進而使ER 中的壓力得以緩解［23］。 據報道，UPR 信號通路的ATF6 和IRE1α 介導的分支是互連的， 它們都參與上調Bip、 XBP1 與ERAD 相關的蛋白質。

3 ERS 介導調控腫瘤能量代謝的分子機制

長期以來， 癌癥已經改變了新陳代謝的方式，以滿足其無限制增殖潛能的需求。 腫瘤微環境中低氧、 細胞外低pH 和低葡萄糖濃度的特征， 在腫瘤的代謝中起到了決定性的作用［6］。 葡萄糖代謝的改變是腫瘤細胞特征之一。 葡萄糖是主要的能源， 在生理條件下， 在線粒體中被氧化， 通過氧化磷酸化生成ATP。 在低氧條件下， OXPHOS 降低， 并且糖酵解途徑被激活。 由于糖酵解產生ATP 的效率低下， 所以腫瘤細胞對葡萄糖的吸收需求更高。 腫瘤細胞以這種方式改變其代謝是因為能節省氧氣， 支持脂質和核苷酸合成以及持續增殖所必需的氧化還原平衡， 同時還能維持足夠的能量產生。 因此， 腫瘤細胞選擇了能量效率低的途徑以維持提供代謝中間體和氧化還原當量用于大規模生物合成［34］。

最近， 許多研究表明， 在ERS 發生時， 其在腫瘤代謝的調控中起到了重要的作用， 相關分子機制也已被揭示。 下面將具體闡述其在腫瘤中的幾個靶點。

3.1 AMPK 參與ERS 對腫瘤代謝的調控 在真核細胞中， 腺磷酸激活的蛋白激酶（AMPK） 在調節細胞能量平衡中起主要作用。 AMPK 可以直接通過結合腺嘌呤核苷酸感受能量的變化， 被相對于ATP 的AMP／ADP 增加激活。 AMPK 的激活增加了分解代謝（ATP 生成） 途徑的速率， 并降低了合成代謝（ATP 利用） 途徑的速率。 除了維持細胞內能量平衡外， AMPK 還調節全身能量代謝。Han 等［35］研究發現一種從藥用植物中分離出來的酚類黃酮Hispidulin， 劑量依賴性地抑制人肝癌細胞生長并通過線粒體凋亡途徑促進細胞凋亡。 進一步研究發現， 經Hispidulin 處理后的肝癌細胞中的ERS 標志物 （磷酸化的PERK 和eIF2α 以及ATF4、 CHOP） 和裂解的caspase-12 的表達以劑量依賴性方式顯著增加。 而在使用選擇性ERS 抑制劑或靶向UPR 蛋白CHOP 的shRNA 預處理后可以有效地扭轉由Hispidulin 誘導的細胞凋亡。 進一步研究發現Hispidulin 有效地增加了AMPK 的磷酸化， 抑制mTOR， 從而阻斷了癌細胞的合成代謝與能量的利用， 促進了凋亡基因的表達。 用AMPK siRNA 或抑制劑處理細胞可顯著消除Hispidulin 對CHOP 表達和凋亡相關蛋白表達的影響， 逆轉了其對細胞的促凋亡作用。 這表明AMPK 參與了ERS介導的Hispidulin 對肝癌細胞的促凋亡作用。Leclerc等［36］研究發現， 二甲雙胍能夠有效誘導急性淋巴細胞白血病（ALL） 細胞凋亡， 具體機制為二甲雙胍可激活AMPK， 上調ERS 標志物IRE1α 和CHOP 導致UPR 介導的細胞死亡。 使用AMPK shRNA， 證明二甲雙胍誘導的細胞凋亡是AMPK 依賴性的， 因為AMPK 敲除可拯救ALL 細胞， 這與IRE1α 和CHOP 的下調以及UPR 功能的恢復相關。 此外， 雷帕霉素可將細胞從二甲雙胍誘導的細胞凋亡和CHOP 表達下調中拯救出來。證明二甲雙胍誘導的淋巴母細胞凋亡是通過完全依賴AMPK 的UPR 介導發生的。 有研究發現， 核糖體S6 激酶2 （RSK2） 在ERS 誘導的乳腺癌細胞自噬中起關鍵作用。 其機制為ER 應激誘導RSK2的激活使Thr172 處的AMPKα2 磷酸化， 導致了細胞能量利用不足， 從而觸發了mTOR 發出的細胞自噬信號［37］。

3.2 AKT 參與ERS 對腫瘤代謝的調控 AKT 是一種絲氨酸／蘇氨酸激酶， 是PI3K 信號通路轉導中的關鍵因子， 是細胞生長和分化的信號分子。更重要的是， p-AKT 是不同細胞中葡萄糖代謝的關鍵調節分子， 在人類神經膠質瘤中， p-AKT 對糖酵解的作用主要是通過調節HK2 向膠質瘤細胞中的線粒體遷移， 從而導致OXPHOX 的抑制作用和大量乳酸的產生。 Hou 等［38］研究發現， PERK在人類神經膠質瘤組織中被顯著激活， 而且在PERK 沉默的神經膠質瘤中， 其細胞腫瘤形成能力降低。 進一步研究其機制發現， 在低葡萄糖代謝應激下， PERK 基因的沉默明顯抑制了細胞的活力、 ATP 和乳酸的產生， 這是由于AKT 和PERK都是重要的癌癥調節因子， AKT 的磷酸化可以通過PERK 激活來調節［39］。 而PERK 基因的沉默則會阻斷AKT 的磷酸化并隨后抑制神經膠質瘤細胞HK2 的線粒體易位， 從而減弱了糖酵解過程和細胞活力。 所以PERK 對腫瘤代謝的調控是通過調節AKT 來實現的。 此外， DeSalvo 等［40］研究發現2-脫氧-D-葡萄糖（2-deoxy-D-glucose， 2-DG）在常氧下誘導ALL 細胞的生長抑制和細胞死亡。進一步研究發現， 經2-DG 處理的ALL 細胞表現出p-Akt 的上調以及ER 應激標記物 （IRE1α、GRP78、 p-eIF2α 和CHOP） 的表達增加。 當使用AKT 抑制劑后， UPR 被抑制， 并使ALL 細胞對2-DG 誘導的細胞死亡更加敏感。

3.3 HIF-1α 參與ERS 對腫瘤代謝的調控

HIF1α 是細胞對低氧反應的關鍵調節因子， 能激活包括血管生成、 細胞存活、 糖代謝和侵襲等在內的與癌癥生物學關鍵方面有關基因的轉錄。 腫瘤內缺氧和基因改變可導致HIF-1α 過度表達， 這與幾種癌癥類型的患者死亡率增加相關。 在臨床前研究中， 抑制HIF-1α 活性對腫瘤生長有顯著影響。 Chen 等［28］研究發現XBP1 在三陰性乳腺癌中被激活， 并在該人類乳腺癌亞型的致瘤性和進展中起關鍵作用。 通過實驗表明在乳腺癌細胞系模型中， 降低XBP1 的表達后抑制了腫瘤的生長和腫瘤的復發。 進一步研究， 在XBP1 轉錄調控網絡的全基因組定位下發現， XBP1 通過與HIF1α 組裝轉錄復合物來驅動三陰性乳腺癌致瘤性， 該復合物通過募集RNA 聚合酶Ⅱ來增強其下游靶標糖酵解相關蛋白己糖激酶Ⅱ（hexokinase Ⅱ， HKII）、 葡萄糖轉運體1 （glucose transporter 1， GLUT1） 和乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase， LDHA） 的表達， 促進了細胞糖酵解的過程， 增強了乳腺癌細胞在缺氧條件下的耐受性， 使其更好地在低氧條件下存活。 相反， Ivanova 等［41］研究發現， 在缺氧條件下， UPR 的PERK 通路的激活可以通過阻止有效的HIF-1α 翻譯來抑制HIF-1α 的水平和活性。 進一步研究發現， PERK 的激活后， 通過阻止RNA 結合蛋白1 （YB-1） 與HIF-1α mRNA 5′UTR 相互作用來抑制從頭合成HIF-1α 蛋白， 減弱了HIF-1α 對下游糖酵解靶標基因的表達， 使癌細胞對缺氧敏感。 而PERK 的化學抑制作用可挽救HIF-1α 缺陷和HIF-1α 活性水平。 證明UPR的PERK 通路的激活可以使腫瘤細胞對低氧應激敏感， 導致其在低氧條件下細胞活力的降低。

3.4 Wnt／β-catenin 信號通路參與ERS 對腫瘤代謝的調控 細胞發育和生長控制中的許多信號通路都參與了缺氧反應， 這包括在胚胎發育、 組織穩態和腫瘤發生中起重要作用的進化保守的Wnt／β-catenin 信號通路。 研究發現， 低氧條件下ERS降低了β-catenin 的穩定性， 從而增強了HIF1α 介導的低氧反應中UPR 的轉錄因子XBP1s 的活性，促使腫瘤在低氧條件下生存并生長。 且研究其具體機制發現， 在具有Wnt 刺激的β-catenin 信號級聯反應的人結腸癌細胞系中， 缺氧時ER 壓力增加伴隨著低密度脂蛋白受體相關蛋白6 的減少， 并且這種減少會導致β-catenin 的積累減少， 使得Wnt／β-catenin 信號轉導受損。 值得注意的是，β-catenin與XBP1 和HIF-1α 相互作用， 抑制了XBP1 介導的HIF-1α 靶基因表達的增加。 此外，在缺氧條件下， Wnt 刺激或β-catenin 的過度表達減弱了XBP1s 介導的細胞存活［42］。 綜上所述， 這些結果揭示了Wnt／β-catenin 途徑減弱了缺氧性UPR 對腫瘤細胞的保護作用， 抑制了細胞的糖酵解過程， 促進了腫瘤細胞在缺氧條件下的凋亡。

4 小結與展望

UPR 是一種信號轉導途徑， 當細胞無法在ER內維持蛋白穩定時被激活。 為了處理ER 腔中錯誤折疊的蛋白質的積累導致的應激， UPR 啟動適應性反應， 來減少蛋白質折疊負荷并增加ER 分泌途徑恢復穩態的能力。 但是， 如果這些糾正措施未能成功恢復ER 內的蛋白穩態， 則UPR 會觸發死亡信號以引起細胞死亡。 與正常細胞不同， 腫瘤細胞的生存面臨著許多對ER 蛋白質穩態的威脅，包括缺氧、 營養缺乏、 蛋白酶體功能障礙以及對分泌途徑的需求增加。 腫瘤細胞有氧糖酵解的這種特殊代謝方式巧妙地與UPR 聯系了起來。 根據腫瘤模型的不同， UPR 激活可調節細胞存活、 能量代謝、 血管生成、 侵襲和轉移。 因此， UPR 正在成為腫瘤代謝中有吸引力的治療靶標， 但是還需要進行更多的研究來了解在任何特定腫瘤類型中調節UPR 的益處和風險。