骨不連的非手術治療進展

吳信舉， 陶周善， 謝加兵， 丁國正

（皖南醫學院弋磯山醫院創傷骨科， 安徽 蕪湖241001）

據統計， 在美國每年約有7 000 萬例外傷發生， 骨折患者約有500 萬例， 術后骨折不愈合患者占骨折患者的5%～10%［1］。 若骨折患者合并開放傷、 免疫性疾病、 骨質疏松、 吸煙酗酒等高危因素， 骨不連發生率更是高達30%［2］。 骨不連表現的斷端異常活動、 負重疼痛、 畸形及功能喪失，會嚴重影響患者的工作及生活質量， 再次行手術治療也會加重家庭及社會的經濟負擔。 因此進一步探討骨不連的治療方法， 可為臨床提供個體化治療的參考依據。 骨不連的定義涉及影像學檢查、不愈合時間及動態觀察時間等多個方面， 國內定義為： 骨折超過6 個月沒有愈合就可診斷為骨不連［3］。 目前國際上較推崇的診斷標準是由FDA 定義的： 骨折9 個月不愈合， 連續3 個月沒有愈合的跡象［4］。 骨折愈合需要穩定的生物力學及生物學環境， 四種物質對骨折愈合骨再生起到關鍵作用， 即： （1） 對骨誘導信號作出反應的干細胞（成骨）； （2） 骨誘導生長因子（誘導干細胞向成骨細胞分化）； （3） 完整的血管供應； （4） 支持細胞附著、 增殖和進入的支架 （骨傳導性基質）［5］。 完成骨再生后， 生物應力又可影響細胞因子的遠期表達。 骨折修復過程在時間和空間完成新骨的生成， 使新生骨的結構和強度與骨折前狀態相似。 目前骨不連物理治療方法主要包括低強度脈沖超聲 （LIPUS）、 電刺激療法、 高壓氧（HBO） 治療、 體外沖擊波刺激（ESWT） 等； 組織工程治療包括經皮自體濃縮骨髓注射、 干細胞、細胞因子、 支架材料等。

1 物理治療

1.1 LIPUS LIPUS 治療可通過選擇超聲頻率強度， 針對目標骨骼及軟組織， 消除腫脹， 促進骨痂組織活性， 縮短愈合時間。 超聲波在對骨折愈合過程的促進作用可能與以下生物學機制有關：（1） LIPUS 可以通過增加堿性磷酸酶（ALP）、 核因子κB 受體活化因子配體（RANKL） 和Runt 相關轉錄因子2 （RUNX2） 來促進干細胞向成骨細胞的分化［6］。 （2） LIPUS 可促進骨折斷端周圍血管增生， 增加細胞因子的運輸及代謝物的清除［7］。（3） LIPUS 在促進骨再生的同時， 還通過增加骨的容積及骨皮質的厚度等方式來增加骨骼的機械強度［8］。

Zhou 等［9］使用人臍靜脈內皮細胞（HUVECs）和人骨肉瘤細胞（MG-63） 來研究LIPUS 在內皮細胞-成骨細胞共同培養系統中的應用， 結果表明LIPUS 可顯著提高HUVECs 的遷移能力， 促進血管生成， 同時可顯著提高成骨細胞中成骨相關基因的表達。 一項關于足踝關節融合術后骨不連的病例研究中， 應用LIPUS 輔助治療， 結果表明在小關節的融合術骨不連中， 治愈有效率達90%［10］。 也有相關研究表明LIPUS 對加快骨不連愈合及縮短負重時間沒有明顯幫助［11］。 但LIPUS治療骨折端不愈合的前提條件是必須具備穩定的生物力學環境， 因此常與骨折斷端植骨內固定術相結合。 后期還需對超聲波治療骨折不愈合的最優參數、 治療期限及配合相應其他治療方法進行更深一步的研究。

1.2 電刺激療法 目前電刺激治療方法分直流電刺激、 電容耦合電場 （CCEF） 和脈沖電磁場（PEMF）。 Muttini 等［12］在研究電流刺激聯合外固定器對綿羊骨折模型骨愈合的影響發現， 電刺激應用于長骨骨折模型可加速骨痂的形成。 一項Me?ta 分析發現， 電刺激作為骨愈合輔助治療可緩解骨不連患者疼痛， 改善愈后的功能［13］。 電刺激療法通過刺激成骨細胞來促進骨的愈合已被證實，Zeighami 等［14］進一步研究了刺激前臂骨折成骨細胞所需的輸入電流， 計算了各骨折斷端形態下的最佳電流。

1.3 HBO 治療 HBO 治療可迅速提高組織氧分壓， 改善組織低氧情況， 促進毛細血管生成， 豐富組織血運， 進而從根本上解決組織乏氧。 劉震［15］發現HBO 可使骨折斷端因子BMP - 2、BMP7、 CD34、 VEGF 表達上調， 從而加快新生骨形成作用， 促進骨折端愈合。 臨床中HBO 常用于骨折不愈合的輔助治療。 李宏宇等［16］通過對小間隙骨不連患者（一般間隙小于1 cm） 的骨不連斷端應用HBO 聯合ESWT， 在治療后的1 年內， 每3個月復查一次X 線片， 結果顯示HBO 聯合ESWT治療效果明顯， 可顯著提高骨不連斷端的愈合率。HBO 為沖擊波治療四肢骨折內固定術后骨不連的協同方法。 Ma 等［17］探討HBO 治療兔開放性脛骨骨折的效果， 通過放射學、 組織學和免疫組化檢查比較實驗組和對照組骨折區， 結果顯示HBO 治療組可減少炎癥反應及再灌注損傷， 促進骨斷端愈合。

1.4 ESWT ESWT 一般在外科中用于腎結石的治療， 沖擊波通過震動產生具有力學特性的聲波，引起介質物理性質的變化。 近年來， ESWT 被骨科用來刺激骨的生長， 治療骨折延遲愈合及不愈合，患者無需再次手術， 可達到愈合效果， 為患者減輕了手術治療的痛苦和經濟負擔。

Valchanou 等［18］應用ESWT 治療骨折延遲愈合和骨不連， 82 例患者中70 例出現骨愈合， 且無并發癥， 并認為沖擊波在治療部位產生微小的骨折卻不損傷周圍組織， 以微小骨折刺激患處重新進入骨折愈合過程。 目前ESWT 的確切作用機制尚不清楚， Schaden 等［19］認為ESWT 致生物反應是由機械作用觸發的， 沖擊波使壓力迅速上升， 組織細胞受到剪切力和拉力， 導致信使從細胞外基質中釋放， 這種基質可以激活細胞核中的基因， 從而誘導生長因子的上調。 李衛等［20］認為沖擊波能夠以定量的機械能對骨組織進行微觀層次的刺激，體現了Wolff 定律和張力-應力法則， 是Wolff 定律、 張力-應力法則在微觀層次的一個重要體現。

一項關于ESWT 治療兔骨不連療效的分析，對于兔骨不連模型， 實驗組采用ESWT 治療3 次，對照組不進行治療， 12 周后用X 線和HE 染色進行修復區的放射學和組織學觀察評分， 結果顯示2組比較差異有統計學意義， ESWT 對治療骨不連有效果［21］。 另一項回顧性研究結果表明ESWT 與手術治療骨不連的愈合率相當， 且ESWT 后無嚴重不良事件報告［22］。

2 再生組織工程

骨不連的再生組織工程材料核心為骨誘導材料、 骨傳導材料和骨促進材料。 骨誘導材料刺激多能干細胞發育成骨細胞； 骨傳導材料有助于骨細胞的黏附和生長； 促骨材料通過釋放各種生長因子間接促進骨形成， 即通過細胞、 支架和生物活性因子的組合完成骨的再生， 為骨不連或大段骨缺損的治療帶來廣泛的應用前景。

2.1 經皮自體濃縮骨髓注射 自體骨髓組織中含有造血干細胞和間充質干細胞（MSCs）， 后者是一類具有多分化潛能的組織細胞， 可以根據骨誘導信號分化為成骨細胞、 軟骨細胞、 脂肪細胞等［23］。 體外、 體內動物和臨床研究已經證實了自體骨髓注射的成骨特性［24］。 Sahu 等［25］研究內固定術后出現骨不連及骨折延遲愈合的患者經皮注射自體骨髓治療的療效， 對93 例長骨延遲愈合（56例） 和不愈合（37 例）， 經皮自體骨髓注射治療，所有患者隨訪24 個月， 結果顯示所有患者均在12周內愈合， 患者預后優良率評分達88.16%。 Islam等［26］對21 例骨不連和骨折延遲愈合的患者進行自體濃縮骨髓注射治療， 15 例患者完全愈合， 愈合率達72%， 術中未見明顯并發癥， 與普通開放骨移植相比， 它是一種簡單、 安全、 微創的方法，尤其適用于麻醉風險高或感染風險高的病例。 經皮骨髓移植是一種微創治療， 它避免了開放式手術導致的相關并發癥。 然而， 如果單獨使用該技術， 可能不足以誘導具有較大骨間隙的復雜骨不連的愈合。

對于經皮自體骨髓移植治療骨不連， 國外有一項關于評估自體骨髓移植祖細胞數量、 濃度對移植后愈傷組織體積和臨床愈合率關系的研究［27］。研究發現， 經皮自體骨髓移植獲得骨愈合的53 例患者成纖維細胞集落濃度高于7 例未愈合者， 且在注射后4 個月時礦化愈傷組織體積與移植時成纖維細胞集落單位數和濃度呈正相關； 經皮自體骨髓移植的效果與抽吸中可用的骨祖細胞數量有關， 因此優化抽吸技術和濃縮過程對于提高成功結果的發生率至關重要［27］。

2.2 干細胞 干細胞組中最受關注的是MSCs［28］。MSCs 是一種以細胞為基礎的治療多種疾病的新技術［29］。 其中骨髓間充質干細胞（BMSCs） 和脂肪來源干細胞（ASCs） 由于其廣泛的分布和物種多樣性而成為研究的熱點。

2.2.1 BMSCs 常通過髂骨翼、 脛骨內側近端或肱骨近端的骨髓抽吸進行， 可以從骨髓中提取MSCs， 直接移植到骨不連部位； 也可多部位提取后， 在移植前進行體外擴增。 汪兆文［30］研究經皮自體BMSCs 移植治療四肢骨折骨不連的療效中，試驗組患者治療有效率為94.44%， 高于對照組的自體松質骨移植治療有效率72.22%， 且未見明顯不良反應。

2.2.2 ASCs ASCs 的特點是脂肪組織豐富， 易于獲取。 Fraser 等［31］報道脂肪組織中MSCs 的頻率是骨髓的500 倍左右。 它們在體外擴增時遺傳穩定， 但ASCs 會產生抑制軟骨細胞增殖和刺激軟骨細胞凋亡的因子［32］， 故不適用于軟骨內骨折的愈合。 Kishimoto 等［33］發現去分化脂肪細胞是一種高度同質、 高度增殖的細胞群， 在適當的誘導條件下具有向成骨細胞、 軟骨細胞和脂肪細胞分化的能力。

2.2.3 骨膜源祖細胞 骨膜是一層100 μm 的薄膜， 覆蓋所有未被軟骨覆蓋的外骨表面［34］。 內形成層直接與外骨皮質相連， 血管化程度高， 是骨軟骨祖細胞的宿主， 具有獨特的組織形成能力。在骨折過程中， 骨膜的祖細胞發生大量增殖， 隨后發生軟骨形成和／或成骨分化［35］。 這導致了愈傷組織的發育， 進一步促進了骨折愈合。

2.2.4 細胞因子 除了治療骨折的機械不穩定外， 生物學缺陷也會導致骨折不愈合。 生物學因素中生長因子起到活化劑的作用， 可在一定程度上促進新骨生成， 另一方面也可通過負性作用抑制骨的吸收破壞。 目前研究較多的是人骨形態發生蛋白（BMP） 和成纖維細胞生長因子（FGF）。

BMP 是強的骨誘導劑。 目前已發現20 個BMP家族成員， 其中研究最多的是BMP-2 和BMP-7。一項關于骨不連微環境中BMP-9 與EGFR 表達的研究中， 骨不連微環境中BMP-9 的表達量較正常骨組織明顯降低， 由此推斷骨不連可能與局部組織中BMP-9 數量減少有關［36］。 有研究表明腎臟在骨代謝中的重要作用， BMP-7 是腎臟中產生的重要活性分子之一， 參與了與骨形成相關的不同途徑［37］。

FGF 利用旁分泌或內分泌信號介導多種生物病理生理過程， 包括血管生成、 傷口愈合、 胚胎發育和代謝調節［38］。 哺乳動物FGF 家族有22 個成員， 其中FGF-2 是再生醫學領域最常用的FGF配體。 有研究表明， 基于干細胞的FGF-2 的治療在紅骨髓中具有成骨作用， 而在黃骨髓中無成骨作用［39］。 Charles 等［40］研究顯示， 高劑量的FGF-2抑制成骨細胞分化的進展， 低濃度的FGF-2 促進成骨。 這表明， FGF2 在促進和抑制成骨的兩個方向上都起作用。 Wallner 等［41］對糖尿病模型小鼠骨骼再生的影響進行研究， 發現1 mm 骨皮質缺損的骨愈合明顯延遲， 成骨標志物表達水平降低， 用醫用膠原蛋白海綿結合FGF-9 予以缺損處治療，可促進骨愈合。

2.3 支架材料 一些細胞因子植入體內后， 并未達到理想的結果， 考慮缺乏支架材料， 植入物并不能在局部固定形成有效的細胞濃度。 支架材料可以為細胞提供保護的三維空間， 同時還可調節細胞的增殖及功能代謝。 可通過三維支架材料與干細胞在體外聯合培養后將有活性的復合物再植入骨不連斷端， 支架材料可提供保護細胞因子增殖的空間， 后期支架不斷降解， 最終完成骨修復。支架材料不僅具備生物相容性和可降解性，還應有良好的力學性能、 孔隙結構及滲透率［42］。適宜的力學性能是支架的三維空間基礎， 力學性能低則不足以提供附著物生存的環境， 過高則可能產生應力屏蔽效應［43］。 多孔支架適用于細胞的附著， 孔隙大小及其相互連通性、 三維表面環境等有利于促進細胞間的接觸［44］。 其在臨床上可用于替代自體骨與異體骨移植， 可模擬骨的組織形態結構及力學特性， 且無來源限制， 為治療缺損性骨不連提供了應用前景。 殼聚糖力學性能也較差， 可與其他支架材料復合提高力學性能［45］。 聚乳酸生物相容性較好， 有一定的力學強度， 但生物活性不足， 降解物可能致機體炎癥［46］。 生物陶瓷機械強度高， 生物相容性好， 三維空隙結構為細胞的增殖分化提供載體基礎。 臨床常用的羥基磷灰石、 β- 磷酸鈣為較好的骨修復材料［47］。 金屬材料在臨床中應用廣泛， 鈦網植骨常用于椎體間融合術， 鈦金屬具有較高的生物相容性及良好的彈性模量、 骨再生能力［48］， 不僅提高與周圍骨組織的整合力， 還可促進骨組織再生。 研究發現，兩種或兩種以上的材料組成的復合材料具有較好的生物活性及力學強度， 彌補了單一材料應用的缺陷， 具有較好的應用前景［49］。 對于一些較大的骨缺損骨不連， 3D 打印技術可以為不同的缺損提供個性化治療， 實現定制骨材料， 是未來醫學發展的方向。

3 小結

分析骨折愈合過程中哪個環節受損， 予以針對性的非手術治療或手術治療， 為骨折端提供合適的生物學環境及生物力學環境， 重新啟動骨折愈合過程。 臨床常用治療骨不連的金標準為內固定植骨術， 重新恢復斷端穩定性， 植骨為斷端提供骨誘導、 骨傳導、 成骨等生物學環境。 考慮到再次手術的創傷及并發癥， 某些穩定的骨不連可以考慮物理方法或微創注射方法治療， 同樣為斷端提供重新愈合的細胞及因子。 合適的骨生物材料可取代自體骨或同種異體骨， 為骨修復的替代物。 再生生物工程可通過在支架上植入細胞或因子， 正好提供了骨折愈合所需的必要因素， 應用前景廣泛。