PD-1 及其配體PD-L1 與乳腺癌的研究進展

張艷珍， 胡蝶， 鄭瑞， 章健， 浦春

（皖南醫學院弋磯山醫院檢驗科， 安徽 蕪湖241001）

2018 年全球癌癥統計， 乳腺癌的發病率和死亡率均居女性癌癥發病和死亡的首位［1］。 在中國，女性最常見的癌癥是乳腺癌， 其次是肺癌、 結直腸癌、 甲狀腺癌及胃癌［2］。 乳腺癌的5 年、 10 年和15 年相對生存率分別為89%、 83%和78%［3］。乳腺癌可分為三種主要的臨床相關亞型， 分別是管腔型， 表達雌激素受體（ER） 和／或孕激素受體（PR）； 人表皮生長因子受體-2＋（HER-2＋）；以及三重陰性， 即缺乏ER、 PR 和HER-2 的表達［4］。 傳統上， 乳腺癌并不被認為是一種特殊的免疫原性腫瘤。 然而， 最近的研究表明， 一些侵襲性三陰性乳腺癌（TNBC） 具有免疫原性， 對化療有抵抗力， 預后不良［5］。 程序性死亡因子1（PD-1） 及其配體（PD-L1） 在生理上調節適應性免疫系統的活動， 以限制過度的炎癥過程， 從而防止正常組織損傷。 腫瘤細胞通過這種途徑逃避宿主的免疫監視， 使其成為相關的治療靶點［6］。盡管現在PD-1／PD-L1 在乳腺癌等實體腫瘤相關臨床療效方面取得了一定的成果， 但仍不完善；目前還是腫瘤免疫治療的研究熱點。 本文將圍繞PD-1／PD-L1 在乳腺癌中相關表達， 免疫檢查點阻斷， 免疫治療臨床研究進展及PD-L1 實驗室檢測臨床應用作一綜述。

1 PD-1／PD-L1 的生物學特征

抑制性受體PD-1 （CD279） 于1992 年在Tasuku Honjo （2018 年諾貝爾生理學和醫學獎獲得者之一） 實驗室被發現［7］。 PD-1 和PD-L1 （又稱B7-H1 或CD274） 均為Ⅰ型跨膜蛋白， 屬于免疫球蛋白（Ig） 超家族。 PD-1 的結構主要包括免疫球蛋白可變區（IgV） 樣胞外結構、 疏水的跨膜區和包含兩個酪氨酸信號基序的細胞質結構區［8］。PD-L1 含有IgV 和免疫球蛋白恒定區（IgC） 樣胞外結構域、 跨膜區和不含典型信號基序的短細胞質尾［9］。 PD-1 廣泛表達于活化的CD4＋、 CD8＋T細胞、 CD4＋調節性T （regulatory T cell， Treg） 細胞、 B 細胞和NK 細胞， 其主要功能是通過抑制T淋巴細胞和B 淋巴細胞的活化維持正常的自身免疫系統穩定狀態［10］。 PD-1 的配體包括PD-L1 和PD-L2 （又稱B7-DC 或CD273）。 PD-L1 在正常健康組織和惡性細胞中廣泛表達， 而PD-L2 主要由抗原提呈細胞表達［11］。 PD-L1 與PD-1 的結合導致T 細胞活化和效應器功能的抑制， 其介導機制是酪氨酸磷酸酶向免疫突觸的募集， 從而擾亂T細胞受體信號傳導［12］。

PD-L1 是兩種已知的PD-1 配體最佳表征，它可以通過腫瘤細胞、 T 和B 細胞、 巨噬細胞和樹突狀細胞表達［13］。 PD-L1 和PD-1 是參與免疫調節的PD 通路的關鍵成員。 PD-L1 與PD-1 相互作用誘導T 細胞抑制。 因此， PD-L1／PD-1 通路已成為免疫檢查點抑制劑治療的關鍵靶點［14］。 腫瘤細胞可以通過常見的致癌信號途徑激活PD-L1的表達。 有研究顯示PD-1／PD-L1 途徑是癌細胞參與免疫逃避的途徑［15］。

2 PD-1／PD-L1 在腫瘤中表達

在乳腺癌中， PD-L1 在不同亞型中的表達差異很大。 PD-L1 的表達在管腔A 型腫瘤中最低（3%～33%）， 在HER2 富集型腫瘤中居中（20%～34%）， 在 基 底 樣或TNBC 中 最 高 （20% ～60%）［16］。 而一些化療藥物如紫杉醇已被證明可誘導PD-L1 的表達［17］。 Muenst 等［18］首次證實PDL1 表達與乳腺癌預后不良相關。

TNBC 的高侵襲性與不良預后不同于其他亞型， 是由于血管內皮生長因子（VEGF） 和其他促進腫瘤細胞生長和遷移的分子的高表達， 以及含有大量腫瘤浸潤淋巴細胞 （tumor infiltrating lymphocyte， TIL） 和腫瘤相關巨噬細胞（tumorassociated macrophage， TAM）［19］。 有 研 究 表 明，TAM 正逐漸成為抗PD-1 和其配體（PD-L1） 藥物活性的關鍵調節劑［20］。 TAM 可以通過Janus 激酶／信號轉導子和轉錄激活子3 （JAK／STAT3） 和磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K） ／AKT 信號途徑分泌干擾素-γ （IFN-γ） 誘導PD-L1 的表達［21］。 而轉化生長因子-β （TGF-β） 還可以通過誘導TAM 向M2 表型的極化增加其抑制活性， 并誘導PD-L1的上調， 從而導致腫瘤逃逸［22］。

有研究表明， PD-1 或其配體PD-L1 在腫瘤中的表達被認為是一種抑制性和／或耗盡性的免疫環境， 允許腫瘤逃避免疫介導的殺傷［23］。 PD-1陽性的免疫環境有助于癌癥的發生［24］。 在乳腺癌中， PD-1 陽性TIL 的存在與乳腺癌的侵襲性腫瘤、 HER2＋狀態和患者生存率低有關［25］。 Yeong等［26］研究發現， PD-1＋免疫浸潤、 腫瘤細胞的PD-L1 表達和相關基因的表達與TNBC 的臨床療效的改善呈正相關。 Dill 等［27］研究發現， 腫瘤細胞和免疫浸潤的PD-L1 表達在同一腫瘤內不同部位的不同核心部位是不同的， 這表明單個活檢可能不能代表整個PD-L1 狀態， 進一步研究腫瘤和免疫基質PD-L1 表達水平與PD-L1 抑制的臨床反應之間的關系將是至關重要的， 尤其是在激素受體陰性的高級別腫瘤中。

3 乳腺癌腫瘤微環境

乳腺癌腫瘤微環境包括淋巴細胞、 巨噬細胞等浸潤性炎性細胞。 其中， CD8＋T 淋巴細胞對腫瘤適應性免疫至關重要［28］。 三級淋巴結構是非淋巴組織在持續刺激下產生適應性免疫反應的重要功能臨時位點， 結構上與次級淋巴器官類似， 其產生需要趨化因子的作用［29］。 在乳腺癌腫瘤微環境中， PD-1／PD-L1 的表達情況參見文獻［30］。

髓源性抑制細胞（myeloid-derived suppressor cells， MDSCs） 是一類在腫瘤微環境中抑制T 細胞活性的異質性髓系細胞［31］。 MDSCs 在B 細胞的增殖、 凋亡、 分泌抗體和細胞因子等免疫功能中也發揮著重要的調節作用。 Shen 等［32］研究表明，MDSCs 的存在降低了PD-1 的免疫檢查點分子百分比， 同時增加了PD-L1 的表達， 進一步發現乳腺癌腫瘤微環境中MDSCs 誘導的PD-1-PD-L1＋細胞亞群具有免疫抑制作用， 證明了PD-1 和PD-L1 對B 細胞的調節可能是免疫治療的重要靶點。

多聚ADP-核糖聚合酶（PARP） 通過誘導自身和其他靶蛋白的多聚ADP-核糖基化參與DNA堿基切除修復［33］。 PARP 抑制劑（PARPI） 可通過上調PD-L1 在乳腺癌細胞系和動物模型中的表達來調節腫瘤微環境， 阻斷PD-L1 的抗體可使PARPI 處理的癌細胞對T 細胞殺傷重新敏感而減弱抗癌免疫， PARPI 和抗PD-L1 的聯合治療與單獨使用兩種藥物相比顯著提高治療效果［34］。

IFN-γ 是一種在腫瘤微環境中具有拮抗作用的多效性細胞因子。 來自于T 細胞和NK 細胞的IFN-γ具有抗腫瘤作用， 而IFN-γ 水平的增加則誘導免疫抑制因子如吲哚胺2， 3 - 雙加氧酶（indoleamine 2， 3-dioxyenase， IDO） 和PD-L1 的產生， 可能提供免疫逃逸機制并促進腫瘤生長［35］。

4 乳腺癌免疫檢查點阻斷

PD-1 是活化T 細胞表達的抑制性免疫檢查點受體， 與腫瘤微環境中癌細胞或免疫抑制細胞表達的免疫抑制信號PD-L1 結合， 是腫瘤免疫逃逸的驅動機制之一［36］。 新的免疫檢查點阻斷策略正在臨床試驗中進行評估， 包括針對淋巴細胞活化基因3 （lymphocyte activation gene 3， LAG-3） 檢查點， 單獨或與PD-1／PD-L1 阻斷聯合使用。Burugu等［37］研究發現， 有50%以上的PD-1＋或PD-L1＋浸潤的乳腺癌同時又有LAG-3＋浸潤。 PD-1／PD-L1 陽性腫瘤與LAG-3 陽性之間的強相關性，正在一些轉移性腫瘤的臨床試驗進行評估， 這表明針對這些免疫檢查點標志物聯合治療具有潛在價值［38］。 有研究顯示LAG-3 是活化T 淋巴細胞表達的細胞受體， 與T 細胞衰竭有關［39］。 臨床前數據表明， LAG-3 阻斷釋放T 細胞效應器功能， 并與其他免疫檢查點抑制劑如抗PD-1 協同作用［40］。有研究者發現美國食品藥品管理局 （Food and Drug Administration， FDA） 批準的抗PD-L1 抗體，即阿替唑珠單抗（Atezolizumab， ATE） 與可上調PD-L1 細胞表面表達或最小化PD-L1 降解的化療化合物相結合， 可協同增強T 細胞介導TNBC 腫瘤細胞的細胞毒性［41］。

微衛星不穩定性 （microsatellite instability，MSI） 是由錯配修復（mismatch repair， MMR） 基因缺陷引起的一種表型。 研究顯示高頻微衛星不穩定性（MSI-H） 腫瘤對PD-1、 PD-L1 等免疫檢測點蛋白有明顯的上調作用， 對免疫檢查點阻斷具有敏感性［42］。 一種抗PD-1 免疫檢查點抑制劑，pembrolizumab， 2017 年5 月被FDA 批準用于治療MSI-H 或MMR 缺陷的不可切除或轉移性腫瘤［43］。

5 免疫治療應用價值

抗CTLA-4、 抗PD-1 和抗PD-L1 抗體被FDA 和歐洲藥品管理局 （European Medicines Agency， EMA） 批準用于治療廣泛的腫瘤疾病，在早期和晚期情況下， 它們能引起持久的臨床反應［44］。 抗PD-L1 藥物ATE 聯合納米顆粒白蛋白結合型紫杉醇化療已被批準用于PD-L1 陽性腫瘤轉移性TNBC 的一線治療［45］。

有研究表明， 用曲妥珠單抗（Trastuzumab）加抗PD-1 抗體聯合治療能顯著提高小鼠HER2＋腫瘤的清除率［46］。 基于曲妥珠單抗的新輔助治療方法可顯著上調HER2＋乳腺癌患者TAM 的PD-L1和IDO 等免疫抑制標記物， 這與曲妥珠單抗反應不良有關［47］。 目前正在進行一項Ⅱ期、 全球性、隨機、 雙盲、 安慰劑對照研究， 評估在曲妥珠單抗-美坦新偶聯物 （Ado-trastuzumab emtansine，TDM1） 中添加ATE 是否能進一步改善轉移性HER-2＋乳腺癌患者的臨床預后， 這些患者以前曾接受曲妥珠單抗和紫杉烷治療 （ NCT 02924883）［48］。

D′Amico 等［49］研究了一種新的靶向HER2 的抗體-藥物偶聯物 （Antibody - drug Conjugate，ADC） 的治療效果和免疫介導的機制， 該ADC 以強效蒽環類抗生素衍生物為有效載體（T-PNU），T-PNU 強烈激活T 細胞， 誘導IFN-γ 上調， 最后， T-PNU 與檢查點抑制劑（ɑ-PD-1） 的結合顯著增強了治療后的腫瘤根除。 Dill 等［50］研究發現免疫抑制酶IDO 在高級別、 TNBC 中表達頻繁，而在低級別、 激素受體陽性的乳腺癌中表達較少，而多數腫瘤PD-L1 陽性患者同時表達IDO， 表明IDO 可能在抗PD-1／PD-L1 免疫治療抵抗中發揮作用， 在這種情況下， 雙重治療可能是有用的。有研究發現PD-L1 在成熟脂肪細胞中的表達明顯高于前脂肪細胞， 核受體PPARγ 是促進脂肪生成的關鍵轉錄因子， 在脂肪生成過程中， 使用PPARγ 拮抗劑（GW9662） 抑制脂肪生成可選擇性降低小鼠脂肪組織中PD-L1 的表達， 增強抗PD-L1或抗PD-1 抗體在同基因乳腺腫瘤模型中的抗腫瘤作用， 這為提高抗癌免疫治療效果提供了一種先前未被重視的方法［51］。

6 PD-L1 實驗室檢測方法及檢測意義

到目前為止， 許多生物標記物已經證明了其有效預測腫瘤反應的能力， 如PD-L1、 腫瘤突變負荷（TMB）、 MSI、 錯配修復缺陷（dMMR）、 腫瘤新抗原負荷（TNB）、 TIL、 效應T 細胞基因標記、 T 細胞受體克隆性、 腸道微生物、 遺傳特征等［52］。 PD-L1 有膜性形式（mPD-L1） 和可溶性形式（sPD-L1） 可供檢測。 PD-L1 檢測方法包括免疫組織化學技術（IHC）、 酶聯免疫吸附測定（ELISA）、 定量免疫熒光 （IF） 和流式細胞術（FC） 等， IHC 在mPD-L1 檢測應用最廣泛， 而ELISA 在sPD-L1 占據主要地位［53］。

Kwa 等［54］闡明目前還沒有PD-L1 生物標記物的標準化測試。 例如， 基于表達細胞類型（腫瘤細胞、 腫瘤浸潤免疫細胞或兩者） 的不同分析，以及mRNA 分析的不同評分方法， 在技術（IHC、DNA 微陣列和原位雜交）、 蛋白質或mRNA 水平上的分析、 IHC 的不同抗體以及使用不同臨界值解釋陽性的可變評分系統方面存在差異。 現已有診斷 性 抗PD - L1 克 隆22C3、 28 - 8、 SP142、SP263 已經獲得FDA 批準應用于臨床。 Barrett等［55］基于IHC、 FC 等技術， 在TNBC 樣本中用流式細胞術對二倍體、 四倍體和非整倍體腫瘤細胞群的細胞核進行分類， 再進行全基因組拷貝數變異測量和寡核苷酸陣列分析， 研究表明基因組損傷可能有助于TNBC 腫瘤細胞中PD-L1 的過度表達。

綜上所述， PD-1／PD-L1 軸的阻斷已成為增強抗腫瘤免疫的治療靶點。 雖然PD-L1 免疫組化評估已被批準作為輔助診斷試驗， 但預測乳腺癌對免疫檢查點抑制劑反應的生物標記物尚未完全優化， 需要進一步改進以優化治療效果。