棉花GhMADS43基因的克隆及酵母自激活分析

張曉紅,李曉琪,張 崢,胡根海

(河南科技學院 生命科技學院，現代生物育種協同創新中心,河南 新鄉 453003)

MADS-box家族基因編碼的轉錄因子廣泛存在于真菌、動物和植物中,其在植物中的功能主要是根、葉片、花和果實等的發育調控[1-3]。AP1和FUL是MADS-box家族基因中的兩類基因,其序列具有很高的相似性,屬于AP1/SQUA基因亞家族,它們在植物莖尖和花分生組織發育的過程中有著重要的作用[4-7]。

擬南芥中,AGL8/FUL基因在植株莖尖、花序和莖生葉中高調表達[8],該基因除了控制植株形態的轉變、莖生葉的生長和復合葉的形態發育,還具有影響果莢的成熟和開裂等功能[9]。擬南芥FUL蛋白調控的靶標基因SAUR10參與莖和花序的分枝角度發育,影響植物的株型發育[10]。番茄FUL蛋白在乙烯調控合成途徑中與1個MADS-box蛋白RIN作用來調控番茄果實的成熟[11-12]。桔梗中也有研究表明,FUL同源基因PlacFL1和PlacFL3可能在調節開花時間和花的發育中起保守作用,而PlacFL2可能參與桔梗休眠調節[13]。禾本科植物AP1/FUL基因重復在其小穗的進化過程中有重要的作用[14]。AP1基因的功能集中于花器官的識別,它在細胞分裂素途徑中能抑制細胞分裂素的合成并激活細胞分裂素的降解,最終阻止萼片的形成[15-16],還可以調控樹木光周期途徑中樹木季節性的生長[17]。然而,AP1/SQUA亞組中基因在棉花莖尖分生組織發育乃至花分生組織發育過程中的功能及調控通路研究仍未見詳細報道。

棉花是我國重要的一種經濟作物,目前，我國棉花種植在向新疆全程機械化推進,其中早熟性和株型是很重要的研究方向[18-20]。為探索MADS-box 家族基因中FUL基因在棉花莖尖分生組織和花發育調控過程中的功能,本研究以棉花栽培種中棉所50和早鈴1號為材料,克隆FUL的同源基因GhMADS43,對其進行組織特異性表達模式及酵母自激活性分析,為后期篩選與該蛋白質相互作用的蛋白質奠定基礎,從而為棉花早熟分子改良提供理論依據。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

所用棉花栽培種材料為中棉所50(CCRI50)和早鈴1號(Zaoling No.1)。試驗所用DNA聚合酶、反轉錄酶、pMD18-T載體、質粒提取試劑盒、膠回收試劑盒和熒光定量試劑盒均購自TaKaRa公司,植物多糖多酚總RNA抽提試劑盒購自天根公司,大腸桿菌感受態細胞DH5α購自康為世紀公司,誘餌空載體質粒pGBKT7、對照質粒pGBKT7-53及酵母菌株Y2HGold購自Clontech,引物合成及序列測定由英駿生物技術有限公司完成。

1.2 材料處理及取樣

試驗材料種植于河南科技學院D407人工氣候培養室,培養條件為長日照,光照/黑暗為14 h/10 h,光照時間為8:00-22:00,溫度為28 ℃,分別選取棉花材料中棉所50在二葉展平時期的根、莖、葉、頂芽、開花當天的花、10 d的纖維和胚珠等不同組織。并于四葉展平期到七葉展平期取2個棉花材料的莖尖樣品,取樣后快速放入液氮中冷凍,并于-80 ℃冰箱中保存備用。

1.3 GhMADS43基因克隆

根據陸地棉基因組序列,設計含有合適酶切位點的特異引物,以棉花莖尖的cDNA為模板,對目標基因進行擴增。PCR反應體系為50 μL,其中10×PCR Buffer 5 μL,dNTPs 4 μL,上下游引物(10 μmol/L)各2 μL,EXTaqDNA聚合酶(5 U/μL)0.25 μL,cDNA模板5 μL,滅菌ddH2O 31.75 μL。反應條件:94 ℃ 2 min;94 ℃ 30 s,55 ℃ 30 s,72 ℃ 1 min,35個循環;72 ℃ 5 min。PCR反應產物用加了核酸染料Gelred的1% 瓊脂糖凝膠電泳檢測,并將陽性克隆送英駿生物技術有限公司測序驗證。試驗中所用PCR引物見表1。

1.4 基因的定量表達分析

使用天根多糖多酚RNA抽提試劑盒提取不同組織樣品的總RNA,所使用RNA的質量需保證A260/280在1.8～2.1,A260/230大于1.8。使用TaKaRa 公司RR047A試劑盒進行反轉錄,使用gDNA Eraser消化總RNA中殘留的基因組DNA,進行30 min反轉錄,合成cDNA。使用SYBR Green分析法并用TaKaRa公司熒光定量試劑盒RR420A對基因進行表達分析,所用儀器為Applied Biosystems Q6實時熒光定量PCR儀。試驗中所用熒光定量PCR引物見表1。

表1 棉花GhMADS43基因克隆及表達所用引物

1.5 誘餌重組載體構建

以測序正確的pMD18-GhMADS43菌液為PCR模板,通過特異性Infusion引物再次擴增GhMADS43的基因序列,并將載體 pGBKT7用限制性內切酶EcoRⅠ和PstⅠ雙酶切形成黏性末端,利用Infusion連接試劑盒進行連接。將連接后的新鮮菌液送英駿生物技術有限公司測序,測序結果正確的陽性克隆即為重組誘餌質粒。

1.6 酵母轉化及快速篩選

參照Clontech公司酵母雙雜交手冊進行酵母菌株Y2HGold 感受態細胞制備和質粒轉化。分別將轉化誘餌質粒后的Y2HGold 酵母菌涂布于SD/-Trp平板,倒置放30 ℃恒溫箱培養3～5 d,挑取SD/-Trp平板上菌落生長良好、直徑約2～3 mm的菌落于1.5 mL無菌離心管,加入含有終質量濃度為50 μg/mL卡那霉素的SD/-Trp液體培養基1 mL,以封口膜封口后在200 r/min的搖床上30 ℃培養10 h,進行PCR鑒定。具體方法: 吸取20 μL酵母菌液于PCR管中,6 000 r/min離心3 min,棄上清液,加入20 μL酵母菌裂解液,渦旋振蕩1 min,沸水浴中處理10 min,-80 ℃冰箱中冷凍15 min,12 000 r/min離心30 s,重復沸水浴和超低溫冰箱冷凍1次,取1 μL上清液作為PCR模板進行檢測。取6 μL PCR 擴增產物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.7 誘餌蛋白毒性和自激活檢測

參照Clontech公司Matchmaker TM Gold 酵母雙雜交系統手冊,將轉化后的重組誘餌載體、pGBKT7-53載體和陰性對照的酵母菌Y2HGold分別加入6 μL 0.9%的NaCl溶液并點于SD/-Trp、SD/-Trp/X-α-Gal和SD/-Trp/-His/-Ade平板上。30 ℃恒溫箱中倒置培養3～5 d,觀察并記錄結果。

2 結果與分析

2.1 GhMADS43基因克隆與分析

將從棉花栽培種材料中克隆到的GhMADS43基因的 CDS 序列,連接pMD-18載體,轉化大腸桿菌感受態細胞DH5α并進行測序驗證。結果表明,GhMADS43基因CDS全長696 bp,編碼231氨基酸(圖1-A)。進化樹分析表明,GhMADS43蛋白與可可中的FUL的同源蛋白TcAGL8親緣關系相近(圖1-B)。

M.DL2000分子質量標記;1.GhMADS43基因的cDNA擴增產物。

2.2 GhMADS43基因的表達分析

組織特異性表達模式分析得出,GhMADS43基因在棉花的根和頂芽中優勢表達,在成熟的花、纖維和胚珠中表達量顯著降低(圖2-A)。選取一式果枝早熟棉早鈴1號和無限果枝早熟棉材料中棉所50從四葉展平時期至七葉展平時期的莖尖分生組織樣品進行表達分析。結果表明,從五葉期開始GhMADS43基因在無限果枝中棉所50中的表達量高于一式果枝早鈴1號,隨著取樣時間的推移,在中棉所50的六葉期和七葉期，GhMADS43基因的表達量顯著高于早鈴1號(圖2-B)。

不同小寫字母表示處理間差異顯著(P<0.05)。

2.3 GhMADS43基因誘餌載體的構建和鑒定

根據測序正確的基因序列設計Infusion引物,以T載體為模板擴增基因序列,并與雙酶切后的誘餌質粒pGBKT7進行重組,轉化子以基因的特異性引物做菌液PCR鑒定。結果表明,成功擴增到GhMADS43全長片段,選取陽性克隆進行測序并對測序結果分析,獲得與預期結果相符且讀碼框正確的序列,成功構建酵母誘餌表達載體pGBKT7-GhMADS43(圖3)。

M.DL2000分子質量標記;1.pGBKT7-GhMADS43誘餌載體質粒提取檢測;2.雙酶切誘餌載體進行驗證。

2.4 誘餌質粒酵母菌的鑒定和毒性檢測

將上述構建好的誘餌載體和陽性對照pGBKT7-53分別轉化至酵母菌株Y2HGold 中,待生長3～5 d后挑取2 mm左右的酵母單克隆在SD/-Trp缺陷培養基中培養過夜,并進行菌液PCR,PCR產物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。結果如圖(圖4-A)所示,誘餌重組質粒和陽性對照質粒轉化后酵母菌落PCR產物條帶大小與目標基因大小一致,說明重組誘餌質粒載體pGBKT7-GhMADS43和陽性對照質粒pGBKT7-53轉化酵母成功。缺陷固體培養結果表明,轉有重組誘餌載體在SD/-Trp平板上和轉有對照的平板上菌落密集程度相似,生長正常,菌落大小均介于2～3 mm(圖4-B)。重組誘餌質粒pGBKT7-GhMADS43和陽性對照質粒pGBKT7-53的菌液過夜培養后,OD600的檢測值分別為1.002和1.121,均超過標準值0.8,說明重組誘餌蛋白對酵母菌Y2HGold 生長無毒性,可進行自激活活性檢測。

圖4 誘餌載體轉化酵母PCR檢測(A)和毒性檢測(B)

2.5 X-α-Gal驗證誘餌載體自激活活性

通過LacZ報告基因的表達來檢測誘餌載體的自激活活性。陽性酵母單克隆轉移至SD/X-α-Gal/-Trp篩選培養基上,待酵母細胞生長3～5 d后,觀察酵母細胞顏色變化情況,陽性對照的酵母細胞變為藍色,陰性對照始終不變藍,而誘餌質粒的酵母細胞的藍色較弱(圖5)。

圖5 X-α-Gal驗證誘餌蛋白自激活結果

2.6 不同濃度3-AT檢測誘餌載體自激活活性

進一步通過His3報告基因的表達與否檢測誘餌載體的自激活活性。His3編碼的酶參與組氨酸的生物合成,其功能可被特異性競爭抑制劑3-AT所抑制。若誘餌載體本身有激活作用,His3報告基因的轉錄被激活,則轉化后的酵母菌能夠在缺陷型平板SD/-Trp/-His/-Ade上生長。將陽性酵母菌株接種至分別添加0,5,10,25,50,75,100 mmol/L的3-AT三缺SD/-Trp/-His/-Ade培養基上。從圖6可以看出,誘餌質粒轉化后的酵母菌在不同濃度三缺培養基中,菌落均不生長,表明誘餌質粒在此濃度下對宿主酵母菌無自激活作用,后續可用于篩選酵母雙雜交文庫(圖6)。

圖6 不同 3-AT濃度檢測誘餌蛋白自激活結果

3 討論與結論

棉花是中國重要的經濟作物,棉花機械化種植生產關乎棉農的切身利益。在綜合性狀發展的前提下,早熟也是棉花品種培育的一個重要目標[21-22]。MADS-box轉錄因子家族與植物葉片、莖尖和花分生組織發育相關[23]。其中FUL基因具有更廣泛的功能,它既能影響葉片和莖尖的發育,又能在花發育的早期促進花序分生組織的形成,并在晚期心皮和角果等花器官發育中行使功能[24-26]。

本研究從棉花栽培種中克隆到FUL的同源基因GhMADS43,發現它在棉花的根和頂芽中表達量較高,而在成熟的花器官中表達量較低,推測該基因的功能可能與根尖和莖尖分生組織的發育和花蕾的前期形成有關。金魚草中FUL的同源基因DEFH28,可以在花序頂端分生組織中表達,從而誘導花序分生組織轉化成花分生組織[27]。AP1和FUL都在花分生組織的發育中起著重要的作用,兩類基因的功能有重疊也有差異,其功能的分歧可能是由于序列的改變,FUL基因的功能主要參與莖葉和果實的發育[24]。FUL蛋白負調控莖尖分生組織中APETALA2基因的表達,導致分生組織和植物花序生長停滯,促進果實和種子出現[28-29]。在擬南芥果莢發育過程中,FUL能控制角果的生長,并促進果莢開裂[30]。棉花中GhMADS43在無限果枝中棉所50中的表達量高于一式果枝早鈴1號,隨著取樣時間的延長表達量也呈增加趨勢,那么該基因是否與棉鈴的成熟和開裂有關,仍值得繼續深入研究。

近年來,酵母雙雜交技術在植物蛋白質互作研究中已成為一種重要手段,在探討植物正常生理功能的分子機制等方面發揮很大的作用[31]。在利用酵母雙雜交系統篩選文庫的過程中,誘餌蛋白表達及自激活活性分析至關重要。一些轉錄因子具有轉錄自激活,嚴重影響后續的篩選工作。因此,將克隆到的GhMADS43基因構建到了酵母雙雜交誘餌載體pGBKT7。分析發現,該蛋白質無自激活活性,可用于后續酵母雙雜交文庫的篩選,為研究該基因在莖尖分生組織發育過程中的功能及調控機理提供一定的基礎。