寒地冬小麥膨脹素基因TaEXPB12同源基因的克隆及功能分析

馮珊珊，徐永清，趙梓頤,李鳳蘭，胡寶忠

(東北農業大學 生命科學學院，黑龍江 哈爾濱 150038)

小麥(TriticumaestivumL.)作為重要的谷類作物，其產量對人類的生活具有重大影響。由于嚴峻的低溫環境，冬小麥在東北地區的種植受到嚴重制約。東農冬麥2號是能在這種嚴寒條件下生存的冬小麥品種，發達的根系是其能夠安全越冬的決定性因素之一，因此，研究其根系生長發育機制對擴大冬小麥在寒地的種植面積具有重要的意義。

膨脹素(Expansin)是一類具有非水解活性的擴展蛋白[1]，在植物的整個生長發育過程中均具有重要作用。膨脹素在植物中包括EXPA、EXPB、EXLA和EXLB 4個亞家族[2]。EXPA和EXPB家族的許多基因都已被證實對植物根系的生長發育具有重要影響。Gahoonia等[3]研究發現HvEXPB1在大麥根中特異性表達，并且直接參與大麥根毛的根原基形成與根毛的伸長。He等[4]發現HvEXPB7基因對大麥根毛的生長具有促進作用。Guo等[5]發現在大豆中，GmEXPB2基因與根毛的伸長有關。Cho等[6]發現OsEXPB3基因和OsEXPB2基因對水稻根系的發育具有重要作用。Zou等[7]發現OsEXPB2基因的表達對水稻根毛的形成及發育具有重要的調控作用，而且當OsEXPB2基因沉默時，會影響側根的生成。Han等[8]發現在氧化脅迫下，過表達TaEXPB23基因的轉基因擬南芥表現出比野生型有更高的鮮質量和更長的初生根。Li等[9]也證明過表達TaEXPB23基因可促進根系生長并使根系鮮質量增加。Lü等[10]發現玫瑰膨脹素基因RhEXPA4的過表達會提高轉基因擬南芥植株側根的數量。Lee等[11]發現敲除擬南芥中的AtEXPA17基因后，植株側根的形成會減少，而擬南芥過表達該基因會促進植株側根的形成。擬南芥AtEXPA4、AtEXPA7、AtEXPA9、AtEXPA14、AtEXPA17、AtEXPA18和水稻OsEXPA1、OsEXPA2、OsEXPA3、OsEXPA4、OsEXPA8、OsEXPA17基因也都被證實與根系的生長密切相關[8,12-14]。除此之外，上述的膨脹素基因也都被證實參與植物抵御外界非生物脅迫的過程。

現在膨脹素對冬小麥根系生長發育的調控機制尚未明確。本研究以東農冬麥2號為材料，得到TaEXPB12-A/B/D3個同源基因。通過生物信息學分析了解其基本的生物學功能；通過qRT-PCR分析，研究了這3個基因在小麥不同部位及在低溫、干旱和激素脅迫下的表達特性及表達差異，以期為進一步研究膨脹素在根系形態建成中的作用提供理論依據。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

試驗材料為冬小麥東農冬麥2號，由東北農業大學植物學研究室提供。RNA提取試劑盒、反轉錄試劑盒、膠回收試劑盒、質粒提取試劑盒、RT-PCR試劑盒、DNA提取試劑盒均購自北京全式金生物公司；引物在長春庫美生物公司合成；測序在哈爾濱擎科生物公司完成；試驗所需大腸桿菌DH5α、農桿菌GV3101、ABA、茉莉酸甲酯、水楊酸、聚乙二醇、LB肉湯、LB 營養瓊脂、氯仿、甘油等生化試劑均購自凱譽生物科技有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 基因序列克隆 根據本研究室的轉錄組測序結果，利用引物設計軟件Primer Premire 5.0分析，設計克隆TaEXPB12-A/B/D基因的特異引物。以兩葉一心期小麥幼苗根為材料，參照說明書使用TransZol Up PlusRNA Kit試劑盒，提取RNA。再以其為模板，獲得cDNA，按照說明書使用TransScript?One-step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix試劑盒進行反轉錄試驗。根據本研究室轉錄組測序結果，以cDNA為模板，TaEXPB12-A利用上游引物F：5′-TAGCCCCTTGGTTTTCTGTC-3′,下游引物R：5′-GTTTCCTAGTGATGTCTTCTTCTTG-3′；TaEXPB12-B利用上游引物F：5′-GCCCATTGGCTTTCT GTCT-3′,下游引物R：5′-CCCTAGCTGGCGTAGTT CA-3′；TaEXPB12-D利用上游引物F：5′-GCCCATTG CCTTTCTGTCT-3′,下游引物R：5′-CCCTAGCTGGC GTAGTTCA-3′進行PCR擴增，退火溫度均為58.5 ℃。

1.2.2 序列生物信息學分析 同源性分析：DNAMAN軟件；染色體定位分析：BioEdit軟件；保守結構域分析：NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi)；蛋白質信號肽預測分析：SignalP 4.1 Server(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)；蛋白質的疏水性及親水性預測：ExPASy-ProtScale(https://web.expasy.org/protscale/)；蛋白三級結構預測：SWISS-MODEL(https://swissmodel.expasy.org/interactive)。

1.2.3TaEXPB12-A/B/D基因啟動子元件分析 利用PlantCARE(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)在線網站對TaEXPB12-A/B/D3個基因序列的啟動子進行功能元件預測分析。

1.2.4 qRT-PCR分析 挑選顆粒飽滿的種子，用75%酒精消毒12 min，無菌水沖洗4～5遍，黑暗條件下浸種12 h，25 ℃培養箱黑暗催芽(保持種子濕潤即可)12 h。然后將種子平鋪于含有雙層濾紙的培養皿中，培養室培養至植株長到兩葉一心期時，隨機選取3株長勢一致的幼苗，以水培為對照組，在4 ℃、20%PEG、30%PEG、2 μmol/L脫落酸(ABA)、10 μmol/L茉莉酸甲酯(MeJA)以及10 μmol/L水楊酸(SA)分別處理2，6，12，24，48 h，分別取單株的根部，隨即液氮速凍，然后置于-80 ℃超低溫冰箱保存備用。以上述處理的冬小麥根cDNA為模板，采用TransStart? Top Green qPCR SuperMix試劑盒(AQ131，北京全式金生物技術有限公司)進行Real-time PCR擴增，擴增體系為20 μL。以分蘗期冬小麥的根、莖、葉、分蘗節的cDNA為模板，用同一試劑盒進行組織表達模式分析。設計的引物具體如下：

熒光引物：上游(TaEXPB12-A-F)：5′-GCTCTAG AATGGCTAGTCCAGGC-3′，下游(TaEXPB12-A-R)：5′-CGGGATCCCTAACTGGCGTA-3′；上游(TaEXPB12-B-F)：5′-GCTCTAGAATGGCTAGTCCAGGC-3′，下游(TaEXPB12-B-R)：5′-CGGGATCCCTAGCTGGCGTA-3′；上游(TaEXPB12-D-R)：5′-GCTCTAGAATGGCTAG TCCTGGC-3′，下游(TaEXPB12-D-R)：5′-CGGGATC CCTAGCTGGCGTA-3′。

內參引物：上游(β-actin-F)：5′-TCCAATCTAT GAGGGATACACGC-3′，下游(β-actin-R)：5′-TCTT CATTAGATTATCCGTGAGGTC-3′。

1.2.5 TaEXPB12-A、TaEXPB12-B、TaEXPB12-D蛋白亞細胞定位 表達載體YFP上含有PmIⅠ酶切位點，而TaEXPB12-A/B/D基因序列上不含PmIⅠ酶切位點，因此，在目的基因TaEXPB12-A/B/D的起始密碼子前和終止密碼子后加入PmIⅠ酶切位點序列，并且加上保護堿基TTT，利用Primer Premire 5.0軟件設計酶切引物(表1)。以已得到的TaEXPB12-A/B/D序列為模板，進行PCR擴增，退火溫度都為58 ℃。用PmIⅠ酶對PCR產物和載體YFP進行單酶切，使用20 μL單酶切體系，37 ℃水浴鍋中2 h，添加1 μL小牛腸堿性磷酸酶(CIP)，再繼續37 ℃水浴1 h，電泳檢測，并對切開的質粒進行膠回收。利用T4連接酶，將上述膠回收的TaEXPB12-A/B/D目的片段和YFP載體片段進行連接，使用20 μL連接體系，輕彈混勻，14.5 ℃恒溫箱中過夜。將連接產物轉化到大腸桿菌中，菌液PCR鑒定和測序后，將重組質粒轉入農桿菌GV3101中，然后瞬時侵染洋蔥表皮。為了區分融合蛋白在細胞膜和細胞壁的定位，將洋蔥表皮細胞用30%蔗糖溶液預處理20 min，使其質壁分離，隨后正常觀察。

表1 酶切位點添加的引物序列

2 結果與分析

2.1 基因序列克隆與同源性分析

目的基因擴增獲得846 bp左右的目的條帶，與預期片段大小相似(圖1)。膠回收，連接T3載體，轉化大腸桿菌，并進行菌液PCR鑒定(圖2)。測序結果與本研究室的轉錄組測序結果進行對比，成功得到TaEXPB12-A/B/D基因。基因序列提交NCBI注冊，GenBank登錄號分別為MT232926、MT232927、MT232928。

M.2K Marker；1-3.菌落PCR產物。

M.2K Marker；1-3.菌液PCR產物。

2.2 序列生物信息學分析

通過DNAMAN軟件進行同源性分析，3條序列的同源性高達98.46%(圖3)。通過BioEdit軟件對測序獲得的3條序列進行染色體定位分析，結果顯示序列1、序列2、序列3分別定位在2AL、2BL、2DL染色體上，編碼281個氨基酸，其長度均為846 bp，依次命名為：TaEXPB12-A、TaEXPB12-B、TaEXPB12-D。除此之外，通過對比發現TaEXPB12基因序列與大麥中的HvEXPB1基因相似性達95%。

圖3 TaEXPB12-A/B/D的氨基酸同源比對

TaEXPB12-A/B/D蛋白質信號肽預測分析顯示，該蛋白質的切割點位于氨基酸25-26位，TaEXPB12-A/B/D基因信號肽序列完全相同。除此之外，生物信息學分析結果顯示，TaEXPB12-A/B/D蛋白均具備膨脹素基因序列特有的結構域DPBB_1，分別位于142-810 bp，142-834 bp，142-834 bp。TaEXPB12-A蛋白的相對分子質量為29.498 31 ku、等電點為9.17、分子式為C1292H1979N369O388S19；TaEXPB12-B蛋白的相對分子質量為29.494 34 ku、等電點為9.16、分子式為C1296H1987N367O388S18；TaEXPB12-D蛋白的相對分子質量為29.496 37 ku、等電點為9.16、分子式為 C1295H1985N367O387S19，3種蛋白質均為親水性蛋白。但是蛋白三級結構預測分析顯示，3種蛋白具有3處明顯差異(圖4)，因此，預測這3種蛋白可能功能略有差異。

圖4 TaEXPB12-A/B/D編碼的蛋白質三級結構的預測

2.3 啟動子反應元件預測分析

對TaEXPB12-A/B/D基因序列的啟動子進行預測分析，結果顯示，均含有與CBF冷反應通路相關的CRT/DRE元件、光響應元件(Light responsive element)、脫落酸響應元件(Abscisic acid responsiveness)、茉莉酸甲酯響應元件(MeJA responsiveness)、干旱誘導響應元件(Drought inducibility)、水楊酸響應元件(Salicylic acid responsiveness)、生長素響應元件(Auxin-responsive element)、赤霉素響應元件(Gibberellin-responsive element)、厭氧誘導響應元件(Anaerobic induction)、低溫響應元件(Low-temperature responsiveness)以及根特異表達相關元件ROOTMOTIFTAPOX1、OSE1ROOTNODULE、OSE2ROO-TNODULE和RHE等。

2.4 TaEXPB12-A/B/D基因的表達特性分析

如圖5所示，qRT-PCR分析結果顯示，TaEXPB12-A/B/D基因均在根中特異性表達。如圖6所示，在不同脅迫處理下，TaEXPB12-A/B/D基因表達趨勢不同。在4 ℃低溫處理的條件下，TaEXPB12-A/B/D的表達量都呈下調趨勢，其中6～48 h顯著下調(P<0.05)，且TaEXPB12-A表達量下降幅度更大。在不同程度的干旱處理后，TaEXPB12-A/B/D的表達量都呈先上升后下降的趨勢，但TaEXPB12-A/B/D對30%PEG更敏感，響應更快。在20%PEG的處理條件下，TaEXPB12-A/B/D的表達量在12 h達到峰值，TaEXPB12-A/B/D的表達量均達到0 h表達量的1.65倍以上，差異顯著(P<0.05)；在30%PEG的處理條件下，TaEXPB12-A/B/D的表達量在6 h表達量最高，約為0 h表達量的3倍，差異顯著(P<0.05)。在脫落酸和水楊酸的處理條件下，TaEXPB12-A/B/D的表達量也都呈先上升后下降的趨勢，其中TaEXPB12-A/B/D在脫落酸處理條件下3 h時達到峰值，為0 h的2.5倍以上，差異顯著(P<0.05)，且TaEXPB12-A的表達占據主導地位，其表達量達到了0 h的3.5倍以上，高于TaEXPB12-B和TaEXPB12-D，而水楊酸處理條件下在6 h表達量最高，約為0 h的13.5倍，差異亦顯著(P<0.05)，說明其對脫落酸的響應更快(峰值提前)而對水楊酸的響應水平更高(增幅更大)。在茉莉酸甲酯的處理下，TaEXPB12-A/B/D的表達量都呈現先下降后上升的趨勢，0～6 h略有下降但差異不顯著，而在6 h后，TaEXPB12-A/B/D的表達量開始上升并在48 h表達量均達到0 h的5.7倍以上，差異顯著(P<0.05)。從根中的基因表達量整體來看，在TaEXPB12-A、TaEXPB12-B和TaEXPB12-D中TaEXPB12-A基因的表達量相對較高。

不同字母表示差異顯著(P<0.05)。圖6同。

圖6 不同脅迫處理下TaEXPB12-A/B/D基因的表達差異

2.5 5TaEXPB12-A、TaEXPB12-B、TaEXPB12-D蛋白亞細胞定位

將含有YFP質粒和重組質粒的農桿菌進行活化，瞬時侵染洋蔥表皮，然后在熒光顯微鏡下觀察洋蔥表皮。如圖7所示，在轉化有35S∶∶YFP陽性對照載體的洋蔥細胞中，熒光信號在整個細胞中都有分布。與陽性對照相比，無論質壁分離前后，TaEXPB12-A∶∶YFP、TaEXPB12-B∶∶YFP、TaEXPB12-D∶∶YFP融合蛋白熒光信號都定位在細胞壁。結果說明，TaEXPB12-A/B/D主要分布在細胞壁中，TaEXPB12-A/B/D編碼的蛋白均為細胞壁蛋白。

A、B.35S∶∶YFP;C、D.35S∶∶TaEXPB12-A-YFP正常;E、F.35S∶∶TaEXPB12-A-YFP質壁分離；G、H.35S∶∶TaEXPB12-B-YFP正常;I、J.35S∶∶TaEXPB12-B-YFP質壁分離；K、L.35S∶∶TaEXPB12-D-YFP正常;M、N.35S∶∶TaEXPB12-D-YFP質壁分離。

3 討論與結論

多倍體化是維管植物的重要進化過程[15]。多倍體化使水稻、小麥等農作物產生了更具有競爭力的新表型，從而在優勝劣汰的自然界留存下來。多倍體化是多倍體物種形成和進化的基礎[16]。因此，研究小麥膨脹素同源基因的表達差異對了解小麥的異源多倍體進化具有重要意義。本研究發現在冬小麥的基因組中，位于不同染色體上的膨脹素同源基因的序列、立體構象存在差異。Hu等[17]研究發現TaEXPA1-A和TaEXPA1-D基因在幼葉中表達，而TaEXPA1-B在幼葉中沉默。Peng等[18]發現TaEXPA8-A和TaEXPA8-B主要在根中表達，而TaEXPA8-D主要在花中表達。董佳敏等[19]發現在不同的非生物脅迫下，TaEXPA7-A/B/D基因均下調表達，但B染色體組上的TaEXPA7-B基因占主要的表達優勢。趙巧芩[20]發現TaEXPA4-A/B/D在抵御不同非生物脅迫的過程中，表達量存在顯著差異。在本研究中，TaEXPB12-A、TaEXPB12-B和TaEXPB12-D的同源性很高，在不同非生物脅迫的處理下，3個同源基因的表達趨勢也一致，但A染色體組上的TaEXPB12-A基因表達量較高。

本研究發現TaEXPB12-A/B/D基因在根中特異性表達，而且通過對比，發現其基因序列與大麥中的HvEXPB1基因相似性達95%。參考小麥與大麥的進化關系和基因之間的相似程度，推測該基因在功能上基本與HvEXPB1一致。已有研究證實HvEXPB1在大麥根中特異性表達，并且直接參與大麥根毛的根原基形成與根毛的伸長。因此，推測TaEXPB12-A/B/D基因可能參與小麥根毛的根原基形成與根毛的伸長。qRT-PCR分析結果顯示，在低溫條件下，TaEXPB12-A/B/D基因的表達呈下調趨勢，這可能是為了減少根的表面積，從而減少寒脅迫所造成的傷害。在干旱條件下，TaEXPB12-A/B/D基因的表達量會先上升，這可能是植物受到旱脅迫早期為了增強吸水能力而促進根毛生長的緣故。TaEXPB12-A/B/D基因編碼的蛋白是細胞壁蛋白，它們可能通過修飾細胞壁來幫助植物抵御外界的非生物脅迫。在啟動子分析中，發現了與CBF冷反應通路相關的CRT/DRE元件，這說明TaEXPB12-A/B/D可能在CBF冷反應通路中承擔著一定的角色。但TaEXPB12-A/B/D基因在小麥根系生長發育中的具體作用還需要進一步的研究。

分別定位于2AL、2B、2DL染色體上的TaEXPB12-A/B/D同源基因，其CDS序列長度均為846 bp，編碼281個氨基酸。TaEXPB12-A/B/D基因高度同源，編碼蛋白質理化性質相似，其編碼蛋白的三級結構有3處明顯差異，這可能使它們的功能有所不同。這3段序列的啟動子區域中均含有與根特異表達相關的作用元件，以及大量激素響應元件和非生物脅迫響應元件。TaEXPB12-A/B/D蛋白在冬小麥根的細胞壁中特異性分布，并參與冬小麥抵御干旱、低溫、ABA、SA和MeJA的過程。