環狀RNA與代謝性疾病研究進展

楊 旭，張致英，康龍麗，馬利鋒

(西藏民族大學環境與疾病相關基因研究高校重點實驗室，陜西 咸陽 712082)

代謝性疾病指體內多種營養性物質代謝異常，這些異常在多種疾病如糖尿病、高血壓、肥胖、心血管疾病和腫瘤等疾病的發生與發展中起著關鍵作用[1]。隨著人們生活質量的逐步提高和飲食結構的調整與豐富，代謝性疾病發生的危險也相應提高。有研究報道，環狀RNA(Circular RNA，circRNA)的代謝失調是導致機體代謝紊亂的主要原因之一，其參與了如糖尿病和心血管疾病等多種代謝性疾病的發生[2]。

1 circRNA的一般特征

在20世紀70年代，有研究者在植物類病毒中首次發現了circRNA，但由于當時知識的局限，研究者們把它誤以為是異常剪接的產物(亦稱為剪接“垃圾”)而沒有足夠重視，直到后來在真核細胞中發現了廣泛表達的circRNA[3]，這才引起人們的廣泛關注。大多數circRNA是由已知蛋白質編碼基因表達的，由一個或多個外顯子通過異常的反向剪接方式形成一個共價閉合環形結構[4]。其實circRNA和大多數線性RNA一樣，具有高度的進化保守性，還包括種屬、組織和疾病在內的特異性[5]。與線性RNA不同的是，雖然circRNA不具有5’末端帽子結構和3’末端多聚腺苷酸尾(poly-A)結構，但是它的穩定性高于線性RNA，這可能與閉合環狀結構受到外切酶的保護有關[6]。另外，這種異常反向剪接的效率要比線性剪接低得多[7]，但是在某些情況下circRNA的豐富度要高于線性RNA[8]。根據circRNA組成序列的不同，可將其細分為位于細胞質的外顯子circRNA[9]、位于細胞核的內含子circRNA[10]以及具備兩者的位于細胞核的外顯子-內含子circRNA(EIciRNA)[11]。但是一般來說circRNA主要位于細胞質[12]，可能存在小RNA(miRNA)反應元件(MREs)[MREs指miRNA通常根據mRNA的3’-非翻譯區(3’-UTR)上特定位置的序列互補結合它們的mRNA靶點]。總體說來，circRNA可以概括為以下幾大特征：①絕大多數circRNA是非編碼RNA；②circRNA比線性RNA更穩定；③在某些情況下，circRNA的豐富度要高于其他相應的線性mRNA；④circRNA在不同物種之間具有高度的進化保守性和種屬、疾病與組織特異性；⑤絕大多數circRNA主要位于細胞質，可能具有MREs。

circRNA的形成機制可以概括為內含子配對驅動的循環化、RNA結合蛋白(RBP)驅動的循環化和套索驅動的循環化三種機制。①內含子配對驅動的循環化：主要成分是順式作用元件(短的非編碼調控序列)，位于反向剪接外顯子的側翼內含子中，能夠在側翼內含子之間進行直接的堿基配對[13]。②RBP驅動的循環化：反式作用因子(結合順式作用元件的蛋白質)識別并停留在位于環狀外顯子兩側的內含子上的特定基序上，通過蛋白質-蛋白質相互作用或這些RBPs的二聚體參與反向剪接反應。雖然內含子配對驅動的循環化和RBP驅動的循環化這兩種機制不同，但可能是一起工作的[14]。③套索驅動的循環化：指在線性剪接過程中形成circRNA的過程。這些circRNA可能來源于在pre-mRNA剪接中內含子的去除或起源于外顯子跨越。

2 circRNA的功能

近年來，隨著高通量測序技術和生物信息學的迅速發展，circRNA在真核生物體內發揮了重要的生物學功能。

2.1 miRNA海綿 circRNA可以作為miRNA的“海綿”發揮作用。所謂海綿作用，指circRNA可以競爭miRNAs并與它們的MREs結合[15]，通過與靶向mRNA 3’-UTR進行堿基互補配對，miRNAs可以阻止靶向mRNA的翻譯，從而影響靶向mRNA的穩定性。值得注意的是，這里僅僅指的是外顯子circRNA能發揮海綿作用，而內含子circRNA與miRNA結合位點比較分散，所以不能發揮海綿作用[16]。有研究[17]表明，在骨關節炎中反義小腦變性相關蛋白(CDR1as)的表達水平顯著上調，與miR-641的表達呈負相關，這是因為CDR1as直接靶向結合miR-641充當其海綿競爭結合MREs。但并不是所有的circRNAs都可以作為miRNA“海綿”來發揮作用的，如腦源性circRNA并不表現出比其相應的線性mRNA更大的能力作為miRNA海綿[18]。所以circRNAs的海綿作用在生物體內得不到大范圍的推廣，其具體的海綿作用機制還需要進一步深入的研究。

2.2 circRNA與RBP相互作用 隨著人們對circRNA功能認識的增加，發現RBPs對circRNA的影響尤為突出。通過RBP驅動的循環機制可知，circRNA生物學功能可以受到RBP的調控。RBP可以與circRNA相互作用，并在circRNA剪接、復制、折疊、穩定和定位中發揮作用。有研究[19]報道，Argonaute蛋白(Ago)家族功能是RNA沉默過程中的核心因素，可以與不同類別的小非編碼RNA包括miRNA結合起來參與mRNA的切割或翻譯抑制。circRNA之所以能發揮海綿作用，可能是由于許多circRNA通過充當Ago2和miRNAs的結合平臺，降低了miRNA與靶向mRNA結合的能力。Ago2可以作為RBP參與circRNA功能的典型代表。也有研究[20]報道，HuR是一種著名的RBP，保持了許多靶向mRNA的穩定性，包括PABPN1 mRNA。研究[21]發現HuR對circRNA的穩定性沒有必要，但能與circPABPN1結合。circRNA可以比它們相應的線性RNA更穩定，且具有更復雜的轉錄調控過程。RBP被證明參與了circRNA翻譯過程，其中m6A內部修飾是哺乳動物mRNA中普遍存在的反轉甲基化。雖然circRNA還含有豐富的m6A修飾，但這還不足以參與蛋白質翻譯。

另外有研究發現，在乳腺癌細胞系MDA-MB-231中，大多數circFoxo3與另一組蛋白質MDM2和p53密切相關。通過與MDM2和p53結合，circFoxo3可以促進p53的泛素化和降解，導致乳腺癌細胞系p53下降。由于circFoxo3MDM2復合物誘導，Foxo3與circFoxo3具有低親和力結合，防止了Foxo3泛素化和降解，導致Foxo3蛋白水平升高，誘導細胞凋亡[22]。這表明特定的蛋白質可以與不同的circRNA結合，而某些circRNA對不同的RBP也具有動態親和力，不是一成不變的。

2.3 轉錄調控與翻譯 circRNA除了具有作為miRNA的海綿作用和與RBP相互作用外，還能在生物體內發揮轉錄調控的功能。目前已有研究發現circTP63在肺鱗狀細胞癌組織中被上調，其上調與患者的腫瘤大小和TNM分期有關。circTP63的異常增高能促進體內和體外細胞增殖。FOXM1被認為是circTP63的主要候選靶點。當circTP63基因敲除時會顯著降低FOXM1 mRNA和蛋白水平，而circTP63過表達時觀察到相反的結果。此外，circTP63可競爭性地與miR-873-3p結合，阻止miR-873-3p降低FOXM1水平，從而上調CENPA和CENPB(細胞周期相關基因)，最終促進細胞周期的進展[23]。雖然在真核生物體內circRNA不能與核糖體結合翻譯蛋白質，但是有研究發現在小鼠體內的circZNF609可以翻譯蛋白質。這可能是由于circZNF609包含一個從起始密碼子和終止密碼子的開放閱讀框(ORF)參與circRNA循環化的形成機制，其發生過程與線性轉錄基本一致。

3 circRNA與代謝性疾病的潛在關系

代謝性疾病是由于體內一些物質代謝異常，引起高血壓、糖尿病、肥胖癥、心血管疾病和癌癥等。隨著人們對circRNA的深入研究，發現其在代謝病的發生、發展中起著重要的作用，很容易在血液、血清、尿液、精液或其他體液中檢測到[24]，circRNA已經成為RNA領域研究的熱點。最重要的是，circRNA已經成為多種代謝性疾病的潛在生物標志物并為疾病的預防和治療提供了新的策略。

3.1 高血壓 高血壓是一種在世界各地人群中常見的慢性疾病，是成人心血管發病率和病死率的主要原因之一。在高血壓患者的各種組織和體液中可以檢測到circRNA的異常表達，如在對100例原發性高血壓(EH)患者的病例對照研究中發現多達287種circRNA在高血壓患者的全血中表達，包括209個上調和78個下調的circRNA。另外，與健康者相比，hsa_circ_0037911在EH患者顯著升高，這可能是hsa_circ_0037911通過充當海綿來抑制miR-637活性，從而促進了EH的發病[25]。另外有研究發現hsa_circ_0014243在EH患者血液中的表達水平也增加，這可能是hsa_circ_0014243作為hsa-miR-10a-5p的特異性海綿在EH中發揮功能[26]。hsa_circ_0037909在EH患者中的表達水平顯著高于健康對照組，其可能影響血清肌酐或低密度脂蛋白，進而導致EH的形成，因此可能是早期診斷EH的重要生物標志物。

3.2 糖尿病 糖尿病(DM)是一種常見的內分泌代謝紊亂性疾病，其特點是由于胰島素分泌作用缺陷和(或)外周胰島素抵抗而導致的慢性高血糖[27]。其中影響患者生存率最大的威脅就是糖尿病的微血管并發癥如視網膜病變等。對此，目前的治療水平是非常有限的，尋找新的反映或預測個體胰島素分泌功能障礙的新標志物來預防和治療糖尿病的微血管并發癥是至關重要的。有研究[28]發現，在糖尿病患者外周血中circRNA與正常對照組比較有統計學差異，其中最顯著上調的是hsa_circ_0054633。circRNA也參與威脅糖尿病患者生命的主要并發癥，如：在糖尿病患者的視網膜病變中circHIPK3顯著升高，而circHIPK3的敲除減輕了視網膜病變；circ_0005015沉默顯著降低了視網膜血管內皮細胞的增殖、遷移和血管的生成，這可能與circ_0005015作為內源性miR-519d-3p海綿抑制其活性有關，而circ_0005015可能是監測糖尿病視網膜病變的理想候選生物標志物。另外，過度表達的cPWWP2A通過抑制miR-579的表達來發揮作用的circRNA也能夠減輕糖尿病引起的視網膜血管功能障礙。

3.3 肥胖癥 近年來隨著人們生活方式和飲食習慣的改變，肥胖患者的數量日益增多。肥胖已經成為多種疾病的主要危險因素，包括糖尿病、心血管疾病、高血壓、冠心病和某些類型的癌癥。circARF3作為內源性miR-103的海綿，通過促進線粒體吞噬減輕脂肪炎癥(導致肥胖發生的重要原因)來預防肥胖。研究[29]發現，孕產婦肥胖會導致后代患上代謝紊亂和肥胖，可通過circRNA_0000660_miR_693-Igfbp1的調節途徑來調控機體靶基因的表達以影響后代的脂質代謝，從而預防代謝紊亂和肥胖的發生。最近有研究[30]報道肥胖患者的認知性癡呆就是高脂飲食引起的。在高脂飲食條件下喂養的小鼠，在大腦皮質中發現與神經發生突觸和鈣信號的有關circRNA表達水平發生了很大的變化。另外也發現了很多非編碼RNA的表達如circRNA，這為高脂飲食引起肥胖的認知性癡呆機制的后續研究奠定了基礎。

3.4 心血管疾病 隨著人口老齡化數量的增多，心血管疾病的患病率和病死率日益增加，已經成為全球死亡人數最多的疾病之一，迫切需要確定新的治療靶點和生物標志物。研究發現在心力衰竭患者的外周血中存在差異表達的circRNA，其中有29個上調和27個下調。hsa_circ_0097435顯著上調會促進心肌細胞凋亡，而沉默會出現相反的結果，它還能通過海綿化多個miRNA在心衰中發揮作用，可能成為心衰患者的潛在標記物和新興治療靶點。也有研究發現，hsa_circ_0007623在缺氧誘導的人臍靜脈內皮細胞中高度表達，并可以充當miR-297的海綿，而miR-297在急性心肌缺血后參與心臟修復。生物信息學分析發現hsa_circ_0007623和miR-297可以直接靶向血管內皮生成因子(VEGFA)，抑制hsa_circ_0007623的表達，減少細胞增殖、遷移和血管生成。功能實驗表明，hsa_circ_0007623沉默可上調miR-297并下調VEGFA，促進心肌缺血后心臟的修復和保護心功能。circMACF1是miR-500b-5p的直接靶標，通過調節miR-500b-5p/EMP軸來阻止心肌梗死的進程，可能是治療心肌梗死的潛在靶標[31]。內皮炎癥是導致冠狀動脈粥樣硬化的一個重要因素，circRELL1可以與細胞質中的miR-6873-3p結合，直接消除miR-6873-3p對炎癥反應的抑制作用，表明circRELL1可以成為冠狀動脈粥樣硬化所致內皮炎癥的一個治療候選標志物。

3.5 腫 瘤 circRNA在腫瘤的發生和發展進程中發揮著重要的作用。研究發現circCCDC66在胃癌組織和細胞中顯著表達，其表達的上調與腫瘤分期和淋巴轉移相關。如果把circCCDC66敲除，會顯著抑制癌細胞的增殖、遷移、侵襲，誘導胃癌細胞凋亡，使其過表達則會有相反的結果。此外，circCCDC66通過激活胃癌細胞中的c-myc和TCF-β信號通路來促進胃癌的生長和轉移，可能成為胃癌診斷潛在的生物標記物。另有研究發現circRBM33的表達與胃癌的臨床特征密切相關，使circ-RBM33沉默會使胃癌細胞的凋亡增加，而癌細胞的增殖、遷移和侵襲減少，其機制是circRBM33通過circRBM33/miR-149/IL-6的靶向軸來控制胃癌的發生和發展。

宮頸癌是女性生殖系統最常見的惡性腫瘤之一，由于手術、藥物和放射治療不能取得滿意的效果，其治療一直是一個難以解決的問題。研究發現circSLC26A4在宮頸癌組織中高度表達，若將其敲除則會抑制體內癌細胞的增殖、侵襲和腫瘤生長。此外，circSLC26A4可以充當miR-1287-5p的海綿，使miR-1287-5p靶向結合HOXA7mRNA的3’-UTR。QKI(一種RBP)可與SLC26A4基因的內QKI反應元件相互作用而促進circSLC26A4的表達，而circSLC26A4可通過QKI/circSshuiLC26A4/miR-1287-5p/HOXA7軸促進宮頸癌的發展。在宮頸癌患者的血清中，circFoxo3a的表達水平顯著降低，與更深的基質浸潤和淋巴結轉移陽性高度相關，能夠更好地反映患者的預后。

前列腺癌是男性生殖系統腫瘤之一。circ_KATNAL1可與miR-145-3p直接結合抑制癌細胞的增殖、侵襲和遷移，但在前列腺癌中被下調。在許多腫瘤中高度表達的WISP1(是miR-145-3p重要的靶基因)與前者的作用相反。研究[32]表明circ_KATNAL1通過miR-145-3p/WISP1在前列腺癌中發揮抗癌作用。circITCH在前列腺癌細胞和組織中的表達顯著降低，其過表達可抑制前列腺癌的惡性表型。此外，miR-17-5P的表達水平與circITCH呈負相關，而HOXB13的表達與circITCH呈正相關，這可能是circITCH充當了miR-17-5P的海綿來增加HOXB13基因表達的結果。

4 結 語

近年來，人們對circRNA形成過程和功能有了進一步的認識，但是也存在一些局限性。單純就海綿作用而言，真正可以在真核生物體內作為miRNA海綿來發揮生物學功能的circRNA數量是有限的，得不到大規模的應用；circRNA與miRNA結合后是否一定抑制miRNA的功能，circRNA 是否與miRNA競爭結合的mRNA存在一一對應的關系以及相關的作用機制，我們還不是很清楚；雖然circRNA參與大多數代謝性疾病的發生與發展，但是對miRNA海綿作用的研究居多，對其他方面機制和功能的探索還處于起始階段，circRNA與疾病之間具體的致病機制還是未知的，這也是我們研究疾病的另一個切入點。今后，我們可以從circRNA除海綿作用之外的其他功能方面去對疾病的具體發病機制進行更加深入的研究。