抗磷脂抗體檢測的標準化現狀

丁亞輝，王文強，李忠信

（鄭州安圖生物工程股份有限公司，河南 鄭州 450016）

1 抗磷脂綜合征

抗磷脂綜合征（antiphospholipid syndrome，APS）是一種非器官特異的自身免疫性疾病，臨床上主要以反復的動靜脈血栓形成，習慣性流產、血小板減少等為主要表現，并伴隨抗磷脂抗體（antiphospholipidantibody，aPL）持續陽性[1-2]。

2 抗磷脂抗體

抗磷脂抗體（antiphospholipid-antibody，aPL）是一組以磷脂或磷脂結合蛋白為靶抗原的自身抗體總稱。aPL通過識別并結合相關磷脂或磷脂結合蛋白來干擾各種依賴磷脂的凝血過程[3-4]。

1906年Wasserman將患有先天性梅毒胎兒的肝臟提取物作為抗原檢測梅毒患者血清中的抗體[5]。相關抗原在1941年被Pangborn從牛肉心臟中提取，并被鑒定為是一種線粒體磷脂，隨后將其命名為心磷脂[6]。Moore等人發現在沒有梅毒相關的任何其他臨床或血清學證據下，只對這種疾病的血液進行篩查，許多SLE患者的VDRL實驗呈現陽性，陽性率高達33%～44%[7]。Conley在1957年描述了2例SLE患者檢測到BFP-STS陽性，其血漿中含有一種獨特的凝血抑制劑，該抑制劑可延長全血滴注時間和凝血酶原時間[8]。由于這種抑制劑主要見于SLE患者，Feistein將次抗凝物質命名為狼瘡抗凝物。1983年，Harris 博士等人開發了用于aCL的放射免疫測定法[9]。1986年，Loizou等將aCL的放射免疫測定法方法進行了改良，建立了酶聯免疫吸附分析法（ELISA）[10]。

1990年GalliM等人認為人/牛的血清/血漿中存在一種可以促進aCL與心磷脂結合的輔助因子。并通過分離提純出50-70KD左右的蛋白，通過分析，其性質與β2糖蛋白1（β2-GP1）非常相似[11]。同時，Matsuura等人發現β2-GP1可以增加aCL與心磷脂的親和力，這種aCL被稱為β2-GP1依賴型aCL，而梅毒患者血清中的aCL與心磷脂的結合卻被β2GP1抑制，因此又將這些aCL稱為非β2-GP依賴型aCL[12]。β2-GP1不僅是一種輔助因子，自身也是APS的一種靶抗原[13]。

3 國際共識以及標準化現狀

抗磷脂綜合征（APS）的初步分類標準是在日本札幌舉行的一次會議后的研討會上制定的。初步分類標準確定了APS的基本特征，以便于病因和治療方式的研究。在第十一屆抗磷脂抗體國際大會上，將APS初步分類標準進行了修訂并延用至今[14-15]。

由于APS臨床上缺乏特異性的表征，APS的臨床診斷大多需要依據實驗室指標。因此，抗磷脂抗體的檢測就顯得尤為重要。在2006年APS札幌標準悉尼修訂版的分類標準中只將狼瘡抗凝物、IgG和IgM型aCL及抗β2-GP1-IgG抗體囊括到實驗室指標中。然而，在臨床診斷中，上述5個指標的陽性率從30%～90%不等[16-19]。隨著對APS的研究的深入，除了分類標準中提到的實驗室指標外，更多抗磷脂抗體逐步被發現并得到認可[16-17]。

aPL最早的標準化研究工作始于1996年，E.N. Harris博士等人對來自各地的30個實驗室進行了一次aCL測試的評估，采用反射免疫法和ELISA法，最終建立了Harris標準血清[20]。截止目前，各商品化aCL試劑盒均溯源到Harris標準血清。然而，各個實驗室之間的檢測結果仍舊存在差異。1995年，一個法國研究小組對9種抗心磷脂抗體試劑盒進行了評估，均采用ELISA法并使用Harris標準血清和試劑盒配套質控進行對照和校準，結果顯示IgG型和IgM型aCL陽性樣本的一致性分別為59%和51%[21]。到2000年，一個歐洲研究小組進行了一次aCL標準化項目，對歐洲使用Harris標準血清進行校準的24家實驗室發放10份樣品，其中只有6家對IgG型aCL的檢測結果一致，但是IgM型aCL的檢測結果均不一致[22]。2013年，北京協和醫院對全國116家實驗室抗磷脂抗體檢測進行了比對分析，結果顯示：從定性分析來看，aCL檢測的陽性符合率可到達96.6%，陰性符合率可達到99.5%，但從定量分析來看，同一廠家的試劑盒在不同實驗室間的變異系數高達31%-90%，不同廠家的檢測結果差異更為明顯[14]。

（1）質控品或者參考品。Harris標準血清是將高滴度的APS患者的血清進行混合后制備的。然而，該血清不可再生，消耗完之后需要重新進行混合制備以及校準，但不同患者的血清中aCL活性有一定的差異性，質量控制難度較大，因此需要建立更為穩定的溯源標準。Ichikawa K等人將鼠單克隆抗體的可變區和人源抗體的恒定區嵌合研制出相應參考品的IgG型aCL（HACL）和IgM型aCL（EY2C9）[23-24]。這種使用基因工程制備的嵌合型抗體更有利于實驗室進行質量控制，但其他類型的aPL還缺少相應的質控品或者參考品。

（2）檢測方法。經典的ELISA法在很長一段時間中作為aCL檢測的主流方法。近些年出現的全自動化學發光法從精密性、準確性、特異性等方面均優于ELISA、可降低實驗室之間的結果差異，更好的服務于臨床。Moerloose等人使用3種化學發光法的商品試劑盒對321個樣品進行檢測，發現其結果天間變異只有4.3%-11.2%，而ELISA的天間變異可能使樣本的陰陽性產生變化，此外化學發光法具有更寬的檢測范圍[25]。

2019年最新發布的抗磷脂抗體檢測的臨床應用專家共識，肯定了一些新技術和非傳統的aPL抗體的檢測價值[26]。但對于aPL標準化的建立似乎未有太多的進展，更多標志物的出現，對標準化的建立帶來了更多的挑戰。

4 討論

近些年人們對aPL的認識和研究越來越深入，非傳統aPL抗體的價值得到了肯定，能夠更好的服務于臨床。此外，隨著檢測技術的更迭，化學發光等方法提高了aPL檢測的精密性和可重復性。但是由于缺乏國際權威組織發布的國際標準品或參考品，除aCL-IgG和aCLIgM外其他aPL也無國際統一單位，導致各廠家定量產品的檢測結果差異較大，一定程度上限制了aPL尤其是非傳統aPL的臨床應用。值得期望的是，目前國內相關組織和機構已經開始開展磷脂項目的室間質評工作，國內的試劑生產廠家也已經推出了基于磁微粒化學發光技術的自動化、定量抗磷脂抗體檢測試劑，在一定程度上為國內抗磷脂抗體檢測的標準化提供了助力。