栝樓薤白半夏湯對心肌缺血再灌注損傷大鼠自噬及PINK1/Parkin通路作用研究?

李 想，張華敏，崔海峰，隋 宇，李盈盈，唐丹麗△

(1. 云南中醫藥大學，昆明 650500； 2. 中國中醫科學院中藥研究所，北京 100700；3. 中國中醫科學院醫學實驗中心，北京 100700)

急性心肌梗死是冠狀動脈粥樣硬化性心臟病的危急重癥，是導致人類死亡的主要病因之一。臨床常用經皮冠狀動脈介入治療或冠狀動脈旁路移植術等方法對急性心肌梗死進行再灌注治療，目的是使梗死區域及時恢復血供，但在血流恢復的同時也會加重心肌的損傷，即心肌缺血再灌注損傷(myocardial ischemia reperfusion injury, MI/RI)[1]。目前MI/RI相關研究雖取得了一定進展，但其機制仍不完全明確。近年來研究發現[2]，線粒體自噬參與心力衰竭、冠狀動脈粥樣硬化、心肌梗死等心血管疾病的發生發展過程, 已經成為防治MI/RI的潛在治療靶點。PTEN誘導假定激酶 (Pink)1/Parkin通路是線粒體自噬依賴的重要通路，在調控缺血再灌注損傷的過程中發揮著重要作用。

栝樓薤白半夏湯出自漢·張仲景所著之《金匱要略》[3]，原書中記載：“胸痹不得臥，心痛徹背者，栝樓薤白半夏湯主之。”課題組前期研究顯示[4-5], 該方具有抑制MI/RI時核轉錄因子-κB(NF-кB)信號通路活化、減輕炎癥損傷的作用，能抑制自噬、改善心肌細胞凋亡。本研究擬通過建立MI/RI模型，從PINK1/Parkin通路介導的線粒體自噬的角度觀察栝樓薤白半夏湯對MI/RI心肌組織的作用, 以進一步闡明該方對MI/RI大鼠心肌的保護作用機制。

1 材料

1.1 動物

雄性SPF級SD大鼠60只，體質量(200±10) g，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，許可證號SCXK-(京)2016-0006。飼養于中國中醫科學院中醫基礎理論研究所實驗動物室，實驗動物室內滅菌水及普通飼料由動物自由攝取，飼養環境為溫度20±2 ℃，濕度(55±5)%。本實驗已通過中國中醫科學院中醫基礎理論研究所實驗動物倫理委員會審查。

1.2 藥物

栝樓薤白半夏湯組成:栝樓24 g，薤白9 g，半夏12 g，黃酒4 L，所有藥材購自北京同仁堂飲片有限責任公司，藥物劑量按70 kg成人每日1 劑原方用量換算出大鼠每日用量，濃縮成含生藥1.3 g/ml的水煎液。自噬抑制劑：3-MA(3-Methyladenine,3-甲基腺嘌呤)購自Sigma公司(貨號M9281)。

1.3 主要試劑及儀器

肌酸激酶同工酶MB(CK-MB)、乳酸脫氫酶(LDH)檢測試劑盒：中生北控生物科技股份有限公司(190951、190751)；Cell Signaling Technology(CST)公司抗體：自噬相關蛋白Beclin-1(lot:3)、選擇性自噬接頭蛋白P62(lot:6)、GAPDH(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,甘油醛-3-磷酸脫氫酶，lot:10)和二抗辣根過氧化物酶標記的羊抗兔免疫球蛋G(IgG)抗體(lot:26)；Abcam公司抗體：Pink1(lot:GR3217577-5)、Parkin(lot:GR3186724-4)和Mfn2抗體(lot:GR211794-1)；電泳儀(BIO-RAD公司)；日立H-7650透射電鏡；酶標儀(SynrgyH1)；離心機(5810R、mikro 200R)；Bio-Rad ChemiDoc成像系統；動物呼吸機ALC-V8(上海奧爾科特公司);多道生理信號采集處理系統(成都儀器廠); 全自動生化分析儀(日本HITACHI公司)。

2 方法

2.1 動物分組與給藥

將60只SD大鼠按隨機數字表法分為假手術組、MI/RI模型組、3-MA抑制劑組、栝樓薤白半夏湯高劑量組、低劑量組，各組動物常規飼養，條件相同。栝樓薤白半夏湯高劑量組按1 ml/100 g(濃度為13 g/kg)，每日灌服對應湯劑。栝樓薤白半夏湯低劑量組給藥量為高劑量濃度稀釋1倍后按相同劑量給藥，其余各組大鼠每日按1 ml/100 g灌服生理鹽水，造模前連續給藥3周。

2.2 動物模型復制

大鼠術前24 h進行最后1次灌胃給藥，并禁食不禁水。腹腔注射20%烏拉坦進行麻醉(按0.5 ml/100 g)后仰臥位固定四肢及頭部，記錄Ⅱ導聯心電圖。頸部、胸前手術野備皮，切開氣管連接動物呼吸機(呼吸頻率80次/min，吸呼比1∶2，潮氣量8 ml/kg)。自左側第3～4肋間剪開皮膚，鈍性分離肌肉組織，打開胸腔撕開心包膜，于左心耳與肺動脈圓錐之間找出冠狀動脈左前降支，并以6-0號縫合線結扎分支起點外約2 mm處(在絲線與心肌間放一根小棉線)，此時缺血心肌壁呈現發紺、膨出，同時記錄心電圖。Ⅱ導聯示ST段弓背上抬，T波高聳，顯示心肌缺血形成。結扎30 min后松開，使缺血冠脈再灌注，關閉胸腔再灌注120 min，心電圖示ST段回落1/2以上，提示造模成功。結扎前心電圖不正常或未到觀察終點死亡以及造模不成功者剔除。假手術組在開胸后不結扎冠脈, 而僅在相應部位用針空穿1次即可。3-MA干預組于再灌注前10 min尾靜脈注射給藥(按20 mg/kg)。

2.3 標本采集及檢測

2.3.1 標本采集 動物模型復制結束后取腹主動脈血，之后迅速剪取心臟，用預冷的生理鹽水沖洗，在冰盤上切取左冠狀動脈供血區的心肌組織和心尖。

2.3.2 血清LDH、CK-MB檢測 取出的腹主動脈血在室溫下靜置30 min，以3000 r/min離心10 min分離血清，按試劑盒說明利用全自動生化分析儀進行檢測。

2.3.3 心肌組織病理形態學觀察 將大鼠心尖部心肌組織用3% 戊二醛4 ℃固定4 h以上，再以1%四氧化鋨4 ℃固定1.5 h后常規脫水，環氧樹脂包埋，制作超薄切片，3%醋酸鈾-枸櫞酸鉛雙染色，透射電鏡下觀察心肌超微結構。

2.3.4 Western Blot法測定心肌組織Beclin-1、P62、Mfn2、Pink1、Parkin蛋白的表達 取大鼠心肌組織標本約50 mg用玻璃勻漿器充分研磨，并加入RIPA裂解液，離心后取上清液用BCA法測定蛋白濃度，于-80 ℃保存。各組按相同總蛋白濃度進行上樣，進行10%SDS-PAGE電泳并電轉移至PVDF膜上，按抗體說明書的推薦方法，用5%脫脂奶粉或5%牛血清白蛋白(BSA)室溫封閉1.5 h后，加入1×TBST稀釋的相應抗體，4 ℃冰箱中孵育過夜，次日取出用1×TBST洗滌，10 min×4次。然后加入二抗，室溫下孵育1.5 h后用1×TBST洗滌，10 min×4次。加入顯影液用Bio-Rad ChemiDoc成像系統顯影，Image Lab 6.0軟件進行圖像分析，以GAPDH作為內參照對比，比值結果表示其蛋白的相對含量。

2.4 統計學方法

3 結果

3.1 心肌超微結構觀察

圖1示，假手術組大鼠心肌肌絲形態完整致密排列，線粒體結構正常，無腫脹，排列較好，嵴突結構正常。MI/RI模型組大鼠心肌肌絲斷裂或疏松，心肌組織線粒體腫脹變大內部結構疏松或空泡化，心肌組織和線粒體內均有自噬體形成。與模型組比較，3-MA抑制劑組、栝樓薤白半夏湯高、低劑量組大鼠心肌肌絲雖有斷裂或疏松，但較模型組程度輕；心肌組織線粒體也腫脹變大，但形態相對完好，嵴突疏松程度較模型組輕。

圖1 各組大鼠心肌超微結構電鏡圖(×30000)

3.2 栝樓薤白半夏湯對心肌缺血再灌注損傷大鼠血清LDH、CK-MB表達的影響

表1示，與假手術組比較，模型組LDH、CK-MB含量升高，差異有統計學意義(P<0.01)；與模型組比較，3-MA組、栝樓薤白半夏湯高、低劑量組LDH、CK-MB含量下降(P<0.01或P<0.05)，抑制劑及各中藥干預組之間比較差異無統計學意義(均為P>0.05)。

表1 各組大鼠血清LDH、CK-MB表達比較

3.3 栝樓薤白半夏湯對心肌缺血再灌注損傷大鼠心肌Beclin-1、P62蛋白表達的影響

表2圖2示，與假手術組比較,模型組心肌Beclin-1、P62蛋白表達升高，差異有統計學意義(P<0.01)；與模型組比較，3-MA組、栝樓薤白半夏湯高、低劑量組心肌Beclin-1、P62蛋白表達下降(P<0.01或P<0.05)。抑制劑及各中藥干預組之間比較差異無統計學意義(均為P>0.05)。

圖2 Beclin-1、P62蛋白表達示例圖

表2 心肌組織Beclin-1、P62蛋白表達比較

3.4 栝樓薤白半夏湯對心肌缺血再灌注損傷大鼠心肌Mfn2、Pink1及Parkin蛋白表達的影響

表3圖3示，與假手術組比較，模型組心肌Pink1及Parkin蛋白表達上升，差異有統計學意義(P<0.05)；與模型組比較，3-MA組、栝樓薤白半夏湯高、低劑量組Pink1、Parkin蛋白表達降低(除高劑量組Parkin蛋白外P<0.05)。與假手術組比較，模型組心肌Mfn2蛋白表達下降，差異有統計學意義(P<0.01)；與模型組比較，3-MA組、栝樓薤白半夏湯高、低劑量組心肌Mfn2蛋白表達升高(P<0.01或P<0.05)。抑制劑及各中藥干預組之間比較差異無統計學意義(均為P>0.05)。

表3 心肌組織Mfn2、Pink1、Parkin蛋白表達

圖3 Mfn2、Pink1及Parkin蛋白表達示例圖

4 討論

心肌細胞的正常結構是維持其功能的形態學基礎，而心肌細胞超微結構的改變是反映細胞損傷程度最直觀的指標。本研究電鏡觀察表明，MI/RI模型組大鼠心肌組織的肌絲斷裂或疏松，心肌組織線粒體腫脹變大，內部結構疏松或空泡化或膜破裂，心肌組織和線粒體內均有自噬體形成，可見線粒體損傷且結構明顯破壞。各藥物干預組的心肌組織結構形態明顯優于模型組，自噬體較少，說明栝樓薤白半夏湯可減輕MI/RI心肌組織及線粒體損傷。

CK-MB、LDH等指標可以用作評價心肌梗死嚴重程度，其中CK-MB是心肌梗死的一個敏感而重要的診斷指標[6-7]，可用于估計梗死面積的大小，它在心肌組織中含量豐富，而在其他組織中幾乎不存在，在血清中的含量越高說明梗死面積越大。本實驗顯示，MI/RI模型組大鼠血清CK-MB和LDH的含量較假手術組顯著增加，提示MI/RI后心肌組織受損。各藥物干預組大鼠血清CK-MB、LDH含量較MI/RI模型組均顯著下降，說明藥物干預可降低心肌酶的釋放，減輕心肌組織的損傷，提示栝樓薤白半夏湯對MI/RI心肌具有保護作用。

自噬是細胞內的物質被自身溶酶體降解的過程，是細胞的一種自我保護機制。研究顯示[8-9]，MI/RI過程中自噬的激活可能導致心肌進一步損傷，過度的自噬會加重再灌注期的組織損傷，對心臟的功能結構造成不良影響。Beclin-1介導的自噬是一個經典自噬途徑，在MI/RI時心肌組織Beclin-1表達增加表明自噬和細胞損傷正在進行[10]。P62也是自噬相關蛋白之一，研究表明[11-12]，在MI/RI時心肌組織的P62蛋白表達增加，表明自噬通量受損，自噬體大量積聚導致細胞損傷甚至死亡。在本實驗中，MI/RI模型組大鼠心肌Beclin-1表達較假手術組顯著增加，提示MI/RI后發生自噬反應，P62表達增加說明自噬反應已經超過自適應限度即發生了過度自噬。過度自噬造成自噬體的大量積累并進一步對心肌組織造成嚴重損傷。各藥物干預組的Beclin-1和P62表達較MI/RI模型組顯著下降，說明栝樓薤白半夏湯能抑制自噬過表達，起到保護心肌、減輕MI/RI的作用。

另有研究顯示[13-14]，上調P62蛋白表達可以加快線粒體分裂，促進線粒體自噬。在線粒體自噬時，由于線粒體外膜上的Pink1降解被抑制而招募胞漿內Parkin轉位至線粒體, 促進線粒體基質蛋白泛素化, 并募集P62到線粒體基質, P62作為信號接頭蛋白進一步介導線粒體自噬與溶酶體結合并促進線粒體降解[15]。同時，Pink1還通過磷酸化消耗Mfn2并促進parkin介導的泛素化，參與線粒體自噬，該過程即為Pink1/Parkin介導的線粒體自噬[16]。實驗結果顯示，與假手術組比較，MI/RI模型組大鼠心肌組織P62、Pink1、Parkin蛋白表達顯著升高，而Mfn2蛋白表達顯著下降，各藥物干預組可抑制P62、Pink1、Parkin蛋白高表達并上調Mfn2蛋白水平，提示MI/RI能夠激活PINK1/Parkin介導的線粒體自噬途徑，從而引發心肌過度線粒體自噬等系列損傷反應。栝樓薤白半夏湯可通過調控PINK1/Parkin通路，減輕線粒體自噬起到保護再灌注后心肌損傷的作用。

綜上所述，栝樓薤白半夏湯對MI/RI大鼠有心肌保護作用，其機制與減少血清心肌酶釋放，減輕心肌線粒體結構損傷，抑制Pink1/Parkin通路激活及心肌過度自噬有關。